糖尿病肾病病人免疫荧光为什么会出现IgG沿小球和小管基底膜和包曼氏囊线样沉积？—附一例糖尿病肾病病例讨论

宋岩

病历摘要：

34岁女性，血糖升高12年，双下肢浮肿2月入院。12年前妊娠时发现血糖升高，诊断妊娠糖尿病，产后血糖降至正常，未再监测血糖，3年前糖尿病酮症酸中毒，间断口服二甲双胍等降糖药物，血糖控制情况不详。

2月前发现高血压及双下肢浮肿，查尿蛋白3+、潜血2+、尿糖2+，血Hb 85g/L， ALB 26.77g/L、Cr 133umol/L，予胰岛素+厄贝沙坦降压+铁剂+补充白蛋白、利尿治疗。1月前复查Scr204umol/L、Hb80g/L，尿蛋白3+、尿糖3+、尿潜血3+。

入院查：BP178/110mmHg，贫血貌，双下肢水肿。化验尿常规PRO 2+、尿潜血BLD 1+、尿糖 1+，尿蛋白定量5.56g/24h、尿变形红细胞70%，Hb77g/L、PLT 252x109/L、ALB26.9g/L、Scr222umol/L，ANCA、GBM、ANA、PLA2R均阴性，B超双肾大小正常。

2019-9-3日肾穿

肾穿刺病理

免疫荧光：

6个肾小球，

IgG 3+，沿肾小球基底膜、肾小管基底膜及包曼氏囊壁线样及系膜区团块样沉积，IgM 2+，系膜区及周边血管袢块样沉积，C3 2+系膜区团块样沉积。

C1q阴性。

免疫荧光可见肾小球基底膜和包曼氏囊壁上IgG线样沉积

IgG沿小管基底膜线样沉积

小球小管基底膜及bemoans囊壁IgG线样沉积，包曼氏囊壁增厚分层

IgG 3+，小球小管基底膜IgG线样沉积

IgG沿小球小管基底膜及bemoans囊壁线样沉积

这个小球IgA阴性

系膜区有IgA可疑团块样沉积，1+-

IgM 3+，在肾小球硬化部位快状沉积

IgM 3+，沉小球系膜区及外周血管袢硬化部位沉积

IgM 3+，外周血管硬化部位快状非特异性沉积

C3 2+系膜区团块样沉积

系膜区可见C3 2+团块样沉积

C1q阴性

光镜：

16个肾小球，7个球性硬化， 1个节段性硬化，余肾小球系膜细胞及基质中度弥漫性增生，可见KW结节及系膜溶解及纤维帽，鲍曼氏囊壁增厚、分层，Masson未见嗜复红蛋白沉积；肾间质多灶状淋巴、单核细胞浸润，水肿伴纤维化，小动脉管壁增厚管腔狭窄，可见入球小动脉玻璃样变性；肾小管基底膜增厚，上皮空泡颗粒样变性伴刷毛缘消失，多灶状小管萎缩。

光镜诊断：结合临床，符合结节性糖尿病肾小球硬化症。

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可见KW结节、系膜溶解和血管袢瘤样扩张，瘤样扩张的血管袢里可见细胞碎片，入球小动脉玻璃样变，包曼氏囊壁和小管基底膜增厚

可见KW结节，小动脉管壁玻璃样变性，间质水肿伴纤维化

小球硬化，未硬化的肾小球可见块状红色的部分为纤维帽即肾小球玻璃样变，间质炎细胞浸润水肿伴纤维化，小管上皮空泡变性刷毛缘消失

小球可见KW结节，包曼氏囊壁增厚，囊内血浆样渗出，肾小管基底膜增厚缺血皱缩

KW结节、纤维帽和包曼氏囊内血浆样渗出、包曼氏囊壁增厚分层、小管基底膜增厚，间质炎细胞浸润水肿伴纤维化

可见KW结节、系膜溶解和毛细血管袢瘤样扩张，纤维帽形成，间质纤维化，包曼氏囊周纤维化，小动脉管壁增厚管腔狭窄

糖尿病肾病病人的肾脏病理免疫荧光为什么会出现IgG沿基底膜甚至包曼氏囊、小管基底膜线样沉积呢？

杨海春教授指出常见的说法是糖尿病肾病的基底膜病变导致粘附性增加，导致白蛋白和IgG沿基底膜呈线状沉积，但是为何不吸附其他种类的免疫球蛋白，就不清楚了。那么糖肾（DN）是否应该也可以有IgM和C3的沉积呢？答案是肯定的，即有IgM、C3沉积，但不如IgG和白蛋白那么多和明显。令人纠结的是这种差异似乎不能用单纯GBM粘附性来解释。还有些疑问，这些IgG和白蛋白是滞留GBM的内皮下、上皮下还是基底膜内？除了GBM成分的贡献，与蛋白的大小、电荷及modification有没有关系?可见问题越来越多了！

文献的报道在晚期糖尿病性肾小球硬化患者中，IgG和白蛋白的线性染色在肾小球基底膜、肾小管基底膜和Bowman囊，这种染色阳性沉积被认为反映了肾小球小管基底膜的结构变化，可能是由于渗透性的改变导致血清蛋白被捕获。认为高级糖基化终产物可能与基底膜结合并改变其性质。是否同样在毛细血管袢IgG的线样沉积也可以如上解释，即终末期糖基化产物与肾小球基底膜结合，改变了基底膜的通透性，才使得血浆蛋白成分沉积，不过如上所说为什么是以IgG为主，而其他的免疫球蛋白却很少呢。再者沉积在肾小管基底膜血浆成分从哪个途径进入肾小管基底膜呢？肾小管重吸收的？

个人认为单纯用GBM粘附性不好解释，而且并不是所有糖肾的病人都有。再就是电镜看到的血浆样渗出都是在内皮下，并没有观察到沿基底膜连续沉积的致密物，而且内皮下的是大的团块样致密物。杨海春教授也同意这一观点，即电镜下观察到的血清样渗出与荧光下线状沉积不符。赵明辉教授认为DN 的IgG线样沉积是由于基底膜胞吞IgG引起的，这种胞吞的是因为基底膜上IgG的膜受体。

正常人和糖尿病患者肾基底膜中的IgG亚型检测证实仅限于IgG4亚类，虽然IgG4血清浓度低于IgG1、IgG2和IgG3。另外，在GBM和TBM上还观察到4种pls在2.7-4.9范围内呈线性分布的阴离子血浆蛋白，而5种等电点较高的血浆蛋白均未检测到，可见糖尿病肾病患者基底膜结合的蛋白予蛋白的等电点有关，低等电点的血浆白蛋白和IgG4可以结合到糖肾的GBM和TBM上，而高等电点的蛋白如IgG1、IgG2、IgG3等则结合不上，提示IgG4和其他带负电血浆蛋白在正常和糖尿病患者肾脏中的选择性结合，在生理条件下，白蛋白和IgG的一个亚类IgG4都是阴离子的，即具有低等电性，这表明血浆蛋白与基底膜的结合是电荷依赖的点分别为4.76和5.5-6.0,7，有研究已经证实表明肾小球毛细血管内存在带负电荷的位点，并提示这些位点为阴离子血浆蛋白的过滤提供了屏障。所以IgG4是线样沉积的。

光镜下内皮下的血清样渗出，渗出的为血浆蛋白，光镜通常描述为“内皮下玻璃样变”。

电镜下可见内皮下大块状的电子致密物沉积，也有内皮下较长的团块状沉积，但并没有看到内皮下连续沉积，和免疫荧光下的IgG连续性线样沉积不符合。

那么不知道IgG或白蛋白的免疫电镜有人做过呢？汤绚丽主任认为观测到的IgG和白蛋白沉积位置是一致的，应该是共同抗原引起的交叉反应。但杨海春教授认为不是抗原抗体反应。不过在人体标本，很难看到在时间轴上内皮损伤和GBM改变对IgG和白蛋白沉积的影响。不妨考虑在animal model上验证一把。

临床看到血浆样渗出是沉积在内皮下的团块状沉积，IgG免疫荧光下是沿基底膜沉积的，再就是电镜看到的血浆样渗出都是在内皮下，并没有观察到沿基底膜上皮下或者基底膜内的沉积物。怎么解释呢？再就是血浆样渗出在糖肾病人的病理里很常见，但只有部分病人的免疫荧光可以看到沿GBM和TBM的线样IgG沉积。

汤绚丽主任同意大的团块状沉积的是血浆蛋白。她们的病例里IgG阳性还是很常见的，全阴的糖肾很少。

讨论：

问题1：高血压导致的继发性FSGS可以出现包曼氏囊壁的球囊滴样病变吗？

高血压导致的FSGS不会有bananas囊壁的滴状病变，这个一般认为是糖肾所特有的。具体机制说不上来，看上去是壁层上皮细胞吞噬了血浆蛋白。一般靠近尿极侧的壁层上皮细胞更接近于近端小管上皮细胞，有更多重吸收功能。壁层上皮细胞从尿极到血管极，其形态和功能改变很大。有研究把它们分为三种亚群。

问题：

2、糖肾的包曼氏囊壁滴样病变的发生机制？

关于bemoans囊壁滴状病变的具体机制说不上来，看上去是壁层上皮细胞吞噬了血浆蛋白。一般靠近尿极侧的壁层上皮细胞更接近于近端小管上皮细胞，有更多重吸收功能。球囊滴（Capsular Drop）对DN还是蛮有特异性的，KW结节和出入球小动脉的玻璃样变对于DN的诊断也很有特异性，但出入球小动脉同时玻变很难找到，而且KW结节如果小球数目少也不一定都能看到。另外，一般GBM增厚在K-W之前，而滴状病变出现的时机不是很明确。

糖尿病肾病的滴状病变的机制解释：壁层上皮细胞从尿极到血管极，其形态和功能上变化很大，有人把他们分成三种亚群。一般靠近尿极的壁层上皮细胞更接近与近端小管上皮细胞，有更好的吸收功能，可能是壁层上皮细胞吞噬了血浆蛋白而导致了滴样病变。

讨论：

问题2：抗GBM病和糖肾在免疫荧光下有何区别？

糖肾lgG线性沉积较弱，累及GBM及TBM，ALB同时阳而；抗GBM病仅GBM受累，阳性较强，TBM及ALB阴性，但由于有抗体交叉性，抗GBM病TBM也可以阳性。抗GBM病IgG常呈节段性，即糖肾的IgG沉积是线样联系的，而GBM的线样沉积常是不连续的，新月体基底膜断裂，但GBM也有没有新月体的肾小球，这时GBM的IgG沉积就是连续线样沉积，但白蛋白荧光阴性。糖肾的IgG常呈线性，白蛋白荧光阳性。再就是糖肾C3阴性，而GBM病C3阳性，但是是沿基底膜颗粒样沉积。

如果病人本身有糖肾，IF如何鉴别是否合并了GBM呢？

1、两者都有IgG+白蛋白，但单纯糖尿lgG染色相对弱，lgG白蛋白。

2、单纯糖肾通常C3阴性，但合并抗GBM病时C3阳性。

3、单纯糖肾沉积的是IgG亚型文献报道是G4，但杭州市中医院的糖肾IgG亚型有阴性，也有1-3阳的，没有G4阳的。而合并GBM时可以是任何亚型。

杨海春教授提出如果开个脑洞：如果把糖尿病肾病和微小病变患者尿里的白蛋白，标上荧光，注入糖尿病肾病小鼠体内，在几个小时之内观察荧光在小球内的沉积。可以得出什么样的结论？

汤大夫提醒可能要用鼠白蛋白的抗体才能结合糖肾的糖蛋白。

上海华山医院谢琼虹主任认为杨老师的设想完全有可能，糖尿病的基底膜增厚和细胞外基质蛋白成分和含量的变化有关，许多纤维化相关ECM(比如我一直关注的TNC是大分子，可以和很多的细胞因子、炎症因子、受体蛋白等结合，所以不除外会trap白蛋白可能，但是在短期内是否能达到荧光检测到的水平就不知道了，而时间长了，带荧光的蛋白会降解，也检测不到，除非不断注射。对了ECM可以结合的蛋白不乏球蛋白超家族的，但这种结合亲和力是很低的，远不如抗原抗体反应。

还有问题吗？

杨海春教授把病理片请Dr. Agnes Fogo看了，Fogo教授也觉得GBM处有点疑问（如图所示：红色箭头所指），需要：1.轻链染色；2.仔细观察电镜。

需要除外单克隆免疫球蛋白沉积病（MIDD）和冷球蛋白血症、FGN、免疫触须样肾小球病等。

可以通过以下办法鉴别HCDD和PGNMID：1）注意IgG荧光的表达，是否肾小球和肾小管基底膜都有类似线状的沉积；2）再者电镜下明确是否肾小球基底膜内侧已经肾小管基底膜外侧都有泥沙或者细小颗粒状电子致密物沉积，如果肾小管都有上述情况，更倾向是重链沉积病，如果肾小管没有上述情况，则要高度怀疑轻链是假阳性，需要进一步验证。

电镜下高倍没有看到基底膜有微管等电子致密物沉积

高倍电镜未看到纤维丝和微管

内皮下血清蛋白渗出出现的大块状电子致密物，多位于小球血管袢外周光镜下纤维帽处

箭头指向也有IgG团块样沉积

左侧没有硬化和节段硬化的肾小球系膜区也可见IgG团块状沉积

系膜区团块样IgG沉积

电镜：

半薄切片:

可见2个肾小球。

电镜:

肾小球系膜细胞和基质中至重度增生、以基质增生为主,系膜区团块状电子致密物沉积，基底膜弥漫质性增，上皮足突广泛融，肾小管上皮细胞空抱变性,溶酶体增多部分萎缩,部分管腔内见蛋白管型酱间质淋巴单核细胞浸润件胶原纤维增生。

电镜诊断：符合糖尿病肾病台并足细胞病，不除外合并免疫复合物介导的肾小球肾炎

系膜区确实有免疫复合物沉积，系膜区可见团块样电子致密物沉积，应该是糖尿病肾病合并IgAN。

感谢北大医院张旭老师的帮助！

讨论：

问题3、糖肾的GBM均质增厚的机制是什么？仅仅是AGEs的沉积吗？无物质沉积的GBM增厚还可见别的疾病吗？

主要是足细胞（podocyte）损伤导致GBM的产生和降解出现新的平衡。其他如特发性结节性肾小球硬化可以有类似DN的GBM改变。

血浆蛋白与基底膜的结合是电荷依赖性的，在生理情况下，白蛋白和IgG4是带负电荷，属于低等电位。研究显示低等电位的蛋白在肾小球基底膜和TBM沉积，而高等电位的蛋白如IgM却检测不到。在正常人肾脏和糖尿病患者中，白蛋白和IgG在肾基底膜（GBM）中呈线性沉积。IgG1、IgG2、IgG3在后一种疾病中，在肌肉和皮肤的血管基底膜中也检测到白蛋白免疫荧光增强。在生理条件下，白蛋白和IgG的一个亚类IgG4都是阴离子的，即具有低等电性，这表明血浆蛋白与基底膜的结合是电荷依赖的【1】。

在正常人和糖尿病肾病患者的肾小球基底膜上会看到白蛋白和IgG的线样沉积，只是糖尿病肾病增多。IgG1、lgG2、lgG3在正常肾脏和DN的GBM上阴性，而IgG4在两者均为阳性，糖尿病肾病的肾小管可见IgG1、lgG2沉积，而抗GBM中均可见到IgG1、lgG2、lgG3、lgG4沉积，至于为什么DN患者基底膜中带负电荷的血浆蛋白结合增加，目前机制不清楚【1】。

参考文献：

1. Selective Binding of IgG4 and Other Negatively Charged Plasma Proteins in Normal and Diabetic Human Kidneys.Am J Pathol 1984,115:443-446.

IgG4和其他带负电血浆蛋白在正常和糖尿病患者肾脏中的选择性结合.

IgG4和其他带负电血浆蛋白在正常和糖尿病患者肾脏中的选择性结合【1】：

为了探讨这种结合可能与电荷有关，作者用免疫荧光技术检测了正常和糖尿病患者肾组织中不同等电点血浆蛋白的存在。这些研究表明，正常肾脏和糖尿病肾脏的肾小球基底膜（GBM）和肾小管基底膜（TBM）中存在低等电点蛋白，而血浆中高等电点（>7）的IgM等蛋白均未检测到。

在2组糖尿病患者、5例终末期患者和4例早期患者的肾脏中，用多克隆和单克隆抗体检测到IgG在GBM和TBM中呈线性分布，强度范围为1-2+。三种抗IgG4试剂的反应性一致，GBM和TBM染色强度为1+。

用两种不同的抗IgG单克隆抗体、两种抗IgG 2单克隆抗体和三种抗IgG 3单克隆抗体均未观察到GBM的反应性。四个DN的肾脏的GBM中存在四个肾脏的gbm中IgG 4，但没有发现其他亚类，第五个DN病人的肾脏中没有检测到IgG亚型。相反，抗GBM肾炎的2例患者的IgG 1、IgG 2、IgG 3和IgG 4单克隆抗体均显示GBM呈线性染色；第3例患者的IgG 2、IgG 3和IgG 4呈线性染色。抗IgG 1、IgG 2和IgG 3单克隆抗体染色的糖尿病肾脏非GBM区：IgG在肾小管上皮中呈颗粒状沉积；IgG 2和IgG 3在部分肾小管中呈局灶性均匀分布。其实DN的IgG的沉积是被动沉积，而抗GBM而是真正的抗体，主动结合，所以比较后者，前者才考虑为假阳性吧，但实际上都是IgG沉积，只是假阳性的叫法不确切。

上文同时解释了为什么糖肾时IgG（G4）和白蛋白会沉积于GBM、TBM而其它IgM不会。所以糖肾时GBM和TBM的lgG线性沉积是确确实实存在的，并非什么”假阳性”。

参考文献：

1. Selective Binding of IgG4 and Other Negatively Charged Plasma Proteins in Normal and Diabetic Human Kidneys.Am J Pathol 1984,115:443-446.

IgG4和其他带负电血浆蛋白在正常和糖尿病患者肾脏中的选择性结合.

2.Glomerular size and charge selectivity in insulin-dependent diabetes mellitus.Kidney International, Vol. 33(1988), pp. 100-106.

胰岛素依赖型糖尿病患者肾小球大小及电荷选择性.

胰岛素依赖型糖尿病肾小球大小和电荷选择性的研究【2】：

文献简介：通过测定血清白蛋白、总IgG、IgG4和（b-2微球蛋白，4种不同大小和电荷的血浆蛋白）的肾清除率，探讨I 型（胰岛素依赖型）糖尿病临床肾病的发病机制。研究对象为70名患者和11名对照者。在尿白蛋白排泄正常（<30mg/24hr）的糖尿病患者中，IgG的部分清除率是对照组的2-3倍，而阴离子血浆蛋白IgG4和白蛋白的部分清除率与对照组相似。这些改变表明肾小球基底膜内的阴离子孔电荷增加，同时伴随着孔大小的增加或肾小管再吸收的损害。糖尿病患者的尿白蛋白排泄量开始上升（30至100毫克/24小时），与白蛋白排泄正常的患者相比，其部分IgG没有变化，而部分IgG4和白蛋白清除率增加了3至4倍；这表明肾小球孔径不变，肾小球滤过性变小，肾小球滤过性变小。阴离子孔电荷减少。在显示尿白蛋白排泄量大于100 mg/24小时的患者中，部分IgG清除率增加到与部分白蛋白清除率相同的程度，表明大孔面积增加。在不同的患者组中，分数微球蛋白清除率与对照组相似，表明肾小管对蛋白质的再吸收没有改变。因此，临床肾病患者大孔面积的增加是由肾小球基底膜的负电荷丢失引起的。阴离子电荷的损失很可能是由于硫酸乙酰肝素蛋白多糖的损失。

第一篇文章是生理，第二篇是病理，两者实验结果和结论惊人地相似。

张志伟老师检索的2篇论文说明了DN的BM沉积的是IgG亚型IgG4。

参考文献：

1.Selective Binding of IgG4 and Other Negatively Charged Plasma Proteins in Normal and Diabetic Human Kidneys.Am J Pathol 1984,115:443-446.

IgG4和其他带负电血浆蛋白在正常和糖尿病患者肾脏中的选择性结合.

2.Glomerular size and charge selectivity in insulin-dependent diabetes mellitus.Kidney International, Vol. 33(1988), pp. 100-106.

胰岛素依赖型糖尿病患者肾小球大小及电荷选择性.