双脱氧核苷三磷酸测序(桑格测序法Sanger测序)

一大步

普通脱氧核苷三磷酸（dNTP）有3'-OH基团，能连接下一个核苷酸，使链延伸。

双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）在3'位置缺少-OH，因此一旦掺入，链就无法继续延伸，即链终止。

测序过程（以手动版为例）：

1. 准备待测的单链DNA模板、引物、DNA聚合酶。

2. 将反应液分到4个试管中，每个试管都包含4种普通的dNTP（其中一种带放射性或荧光标记），再分别加入一种特定的ddNTP（如ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）。ddNTP与dNTP的浓度比例经过调整，使链终止随机发生。

3. 延伸与终止：DNA聚合酶开始合成新链。当遇到需要掺入ddNTP时，链就此终止，从而产生一系列不同长度的DNA片段，这些片段的最后一个核苷酸就是对应管中的ddNTP。

4. 电泳分离：将4个试管中的产物分别加入聚丙烯酰胺凝胶的4个泳道进行电泳。短片段跑得快，长片段跑得慢，从而按照长度分开。

5. 读取序列：通过放射自显影或荧光检测，从凝胶底部向上读取各泳道的条带顺序，就能直接推断出原始DNA的序列。