双层平板法

一大步

双层平板法，专门用于测定样品中噬菌体的数量（即噬菌斑形成单位，PFU/mL）。具体原理和流程如下：

一、实验原理

将高浓度的敏感指示菌（如大肠杆菌）与待测样品混合，然后倾注在已凝固的底层培养基上形成上层“软琼脂”。培养后，噬菌体感染并裂解细菌，在菌苔上形成透明圆斑（噬菌斑）。每个噬菌斑通常源于一个原始噬菌体颗粒，通过计数即可推算原始样品中的噬菌体浓度。

二、详细操作步骤

1. 制备底层平板：先倒入2%普通琼脂，凝固后作为支撑层（防止上层被划破或裂开）。

2. 混合上层液：将约3-5 mL的1%琼脂（浓度低，琼脂软）熔化后冷却至45-48℃，加入敏感菌液和待测污水样（或稀释液）；立即混匀倒在底层上。

3. 铺匀凝固：迅速转动平板使上层均匀铺开，静置凝固。

4. 培养：倒置培养6-18小时（依噬菌体而定）。

5. 计数：直接数噬菌斑，乘以稀释倍数得到原始样品中的噬菌体数量（PFU/mL）。

三、为什么用双层法（优势）

清晰易读：软琼脂让噬菌斑扩散更圆、更大，不互相重叠或蔓延。

防止菌苔裂开：底层高强度琼脂支持整块平板，上层软琼脂不影响细菌生长。

避免游离噬菌体蔓延：低浓度琼脂限制噬菌体扩散速度，但裂解后仍能形成清晰斑。

四、计算公式

五、例题

A错：培养基一般用高压蒸汽灭菌，不能用干热（会破坏营养）；培养皿可以用干热。

B错：T2噬菌体专一侵染大肠杆菌，不能以酵母菌为指示菌。

C错：上层培养基冷却到45-48℃是防止烫伤敏感菌，而不是防止底层液化（底层已凝固）。

D对：上层琼脂浓度低（1%），软琼脂让噬菌斑向外扩散更大，便于肉眼计数。