mNGS/tNGS低序列结核分枝杆菌检测结果解读SOP（完整版）

甘肃 （wsw）

1 目的

规范宏基因组二代测序（mNGS）、靶向二代测序（tNGS）技术检测结核分枝杆菌（MTB）时，低序列阳性结果的标准化解读流程，明确各环节操作要求、判断标准及报告规范，确保检验结果解读的准确性、一致性和临床指导性，避免误判导致的过度治疗或延误诊治。

2 适用范围

本SOP适用于各级医疗机构检验科室、第三方检验机构中，经mNGS/tNGS检测后，MTB序列数满足“≥1条且＜实验室设定阳性阈值”（常规阳性阈值建议10-50条，需基于本实验室试剂性能、测序平台及临床验证数据校准）的所有样本类型，包括但不限于：

- 呼吸道样本：痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、鼻咽拭子；

- 无菌体液样本：脑脊液、胸腹水、心包液、血液；

- 组织样本：淋巴结、肺组织、病灶穿刺组织；

- 其他样本：粪便、尿液等。

3 术语与定义

3.1 核心术语

- 低序列阳性：MTB序列数≥1条且＜实验室设定阳性阈值，测序质控合格且无明确污染证据的检测结果；

- 测序质控合格：原始序列（Raw reads）经过滤后得到的有效序列（Clean reads）Q30≥80%，目标序列比对率≥95%，宿主核酸占比＜95%（无菌体液可放宽至＜98%）；

- 污染阳性：同批次无模板对照（NTC）检出MTB序列，或样本MTB序列数＜10倍NTC序列数，或通过decontam软件判定为污染序列；

- 明确致病菌：MTB复合群属于高致病性病原，即使低序列也需重点关注（排除污染后），其核酸提取效率低、胞内寄生特性导致游离DNA少，低序列可能提示真实感染；

- 临床复合标准：结合患者临床症状、影像学结果、传统病原学检测（涂片、培养、IGRA/TST）、治疗反应及暴露史形成的综合诊断依据。

3.2 技术特性区分

- mNGS：无偏性检测，覆盖广谱病原，低序列可能因低菌量感染、宿主核酸干扰导致，灵敏度高但特异性略低于tNGS；

- tNGS：通过引物扩增或探针捕获靶向富集MTB序列，低序列更可能提示低菌量感染（污染概率低于mNGS），但可能受靶标覆盖范围限制漏检耐药突变株。

4 前置条件与职责分工

4.1 前置条件

- 实验室已完成mNGS/tNGS检测流程的标准化验证（包括精密度、准确度、检出限）；

- 建立完善的室内质控体系，每批次检测均设置阳性对照、阴性对照（NTC）及空白对照；

- 解读人员需具备微生物学、分子生物学专业背景，经mNGS/tNGS结果解读专项培训并考核合格。

4.2 职责分工

- 测序技术员：负责完成测序实验、数据过滤及初步质控分析，输出质控报告及原始序列数据；

- 检验医师：主导低序列阳性结果的污染排查、临床信息整合、分级判定及报告撰写；

- 科室审核人员（中级及以上职称检验医师）：负责复核解读逻辑、分级结论及临床建议的合理性，签发最终报告；

- 临床对接专员：负责与临床医生沟通解读结果，收集患者后续诊疗信息，建立结果随访数据库。

5 标准化解读流程（Step-by-Step）

5.1 第一步：测序数据质控核查（T+1个工作日）

1. 核查核心质控指标：有效序列Q30值、比对率、宿主核酸占比，确保符合“测序质控合格”标准；

2. 异常数据处理：若质控指标不达标，判定为“结果无效”，需在报告中注明原因（如样本降解、宿主核酸过高），建议重新采样检测；

3. 输出质控结论：明确标注“质控合格”或“质控不合格”，不合格结果终止后续解读流程。

5.2 第二步：污染系统排查（T+1个工作日）

采用“三重验证法”排除污染，任一环节提示污染则判定为“污染阳性”：

1. 对照样本比对：同批次NTC检出MTB序列时，若样本MTB序列数＜10倍NTC序列数，直接判定污染；

2. 分类学注释验证：使用Kraken/MetaPhlAn等工具分析微生物构成，若非目标微生物序列占比＞0.1%（血液/脑脊液样本）或＞1%（痰液/粪便样本），结合污染物种类型辅助判断；

3. 统计去污验证：通过decontam软件的浓度模型或频率模型，判定MTB序列是否为污染序列（输出isContaminant=TRUE则提示污染）；

4. 批次效应检查：若同一批次多个无关样本均检出MTB低序列，提示实验室环境或试剂污染，需暂停检测并排查污染源。

5.3 第三步：样本关联性分析（T+1个工作日）

根据样本类型的无菌性、采集方式评估结果可靠性，优先级排序：

1. 高可靠性样本：无菌体液（脑脊液＞胸腹水＞血液）+ 侵入性采集（如穿刺、手术取材），污染概率极低，低序列更可能提示真实感染；

2. 中可靠性样本：呼吸道样本（BALF＞痰液）+ 规范采集（如晨痰、合格痰标本），需结合定植菌背景排除干扰；

3. 低可靠性样本：非规范采集样本（如随机痰液、污染尿液）、定植菌高发部位样本（如口腔拭子、粪便），低序列大概率为定植或污染。

5.4 第四步：临床信息整合（T+2个工作日）

通过电子病历系统或临床沟通收集以下信息，形成整合分析表：

1. 临床症状：是否存在结核相关症状（发热、盗汗、乏力、咳嗽、咯血、体重下降等）及持续时间；

2. 影像学结果：胸部CT/DR、病灶部位影像学特征（如结核球、空洞、胸膜增厚、淋巴结肿大等）；

3. 传统检测结果：痰涂片抗酸染色、MTB培养（金标准）、IGRA（γ-干扰素释放试验）、TST（结核菌素试验）结果；

4. 患者基础状态：是否为免疫低下人群（HIV感染、化疗后、器官移植受者、长期使用激素）、有无结核暴露史、既往结核病史及治疗情况；

5. 治疗反应：若已使用抗结核药物，评估症状、影像学是否改善。

5.5 第五步：结果分级判定（T+2个工作日）

基于“质控状态-污染排查-样本可靠性-临床信息”四维度，将结果分为4级，明确每级判定标准及临床意义：

分级 判定标准 核心临床意义

Ⅰ级（高度提示感染） 1. 质控合格+无污染证据； 2. 高/中可靠性样本； 3. 满足以下任一条件： - 无菌体液样本+临床症状阳性； - 临床症状+影像学异常； - 传统检测（涂片/培养/IGRA）阳性/可疑 低序列大概率为低菌量感染（如早期结核、肺外结核、治疗后残留病灶），可作为确诊重要辅助依据

Ⅱ级（疑似感染） 1. 质控合格+无污染证据； 2. 任意样本类型； 3. 临床症状阳性或影像学异常，但传统检测阴性 存在真实感染可能（如传统检测灵敏度不足），需进一步验证

Ⅲ级（低可信度） 1. 质控合格+无明确污染证据； 2. 低可靠性样本； 3. 无结核相关症状、无影像学异常，传统检测阴性 大概率为既往感染残留核酸、定植或轻微污染，临床意义有限

Ⅳ级（污染阳性） 1. 质控合格但污染排查提示污染； 或 2. 质控不合格 结果无效，不能作为感染依据

5.6 第六步：报告撰写与审核（T+3个工作日）

1. 报告核心要素：需明确标注以下内容，避免模糊表述：

- 基础信息：患者信息、样本类型、采集时间、检测方法（mNGS/tNGS）；

- 测序数据：MTB序列数、阳性阈值、质控指标（Q30、比对率、宿主核酸占比）；

- 污染排查结果：NTC情况、去污分析结论；

- 分级结论：明确Ⅰ-Ⅳ级判定结果；

- 临床建议：结合分级给出针对性建议（如重复采样、诊断性治疗、随访观察等）；

2. 报告审核：科室审核人员复核全部流程及结论，重点核查分级依据的完整性、临床建议的合理性，审核通过后签发；

3. 报告修改：若临床补充关键信息（如后续培养阳性、症状加重），可对报告进行补充说明并重新签发。

6 不同场景临床建议细则

6.1 Ⅰ级（高度提示感染）

- 无菌体液样本（如脑脊液）：优先启动抗结核治疗（尤其免疫低下人群），同步完善MTB培养及耐药基因检测，调整治疗方案；

- 呼吸道样本：结合痰培养结果，若培养阳性按标准方案治疗；培养阴性则启动诊断性治疗（2-4周），评估症状及影像学改善情况；

- 治疗中患者：提示病灶残留或治疗效果不佳，建议复查测序（对比序列数变化）、调整抗结核药物组合。

6.2 Ⅱ级（疑似感染）

- 优先重复采样检测：同一部位规范采集2-3份样本，或换用高灵敏度方法（如tNGS靶向加深测序）；

- 联合补充检测：完善MTB核酸PCR、延长培养时间（至8周）、多部位影像学检查；

- 诊断性治疗指征：免疫低下人群、结核暴露史明确、临床高度怀疑且无其他病原证据时，可谨慎启动诊断性治疗。

6.3 Ⅲ级（低可信度）

- 不建议盲目抗结核治疗：避免药物不良反应及耐药风险；

- 短期随访观察：1-3个月后复查，若出现症状或影像学异常，重新评估；

- 特殊人群管理：免疫低下人群需缩短随访周期（1个月），密切监测症状变化。

6.4 Ⅳ级（污染阳性）

- 报告中明确标注“结果受污染影响，无临床诊断价值”；

- 建议重新规范采集样本检测（排查采样污染），或更换试剂批次后检测（排查试剂/环境污染）。

7 质量控制与持续改进

7.1 室内质控要求

- 每批次检测必须设置3类对照：阳性对照（已知MTB序列样本）、阴性对照（NTC）、空白对照；

- 定期校准阳性阈值：每6个月基于临床验证数据（至少50例确诊结核患者、50例非结核患者样本）调整阈值，确保灵敏度≥90%、特异性≥85%；

- 污染率控制：MTB低序列结果中污染率需≤10%，超过则启动根因分析（如实验流程、环境、试剂）。

7.2 持续改进机制

- 建立结果随访数据库：记录低序列阳性患者的后续诊疗结果（如确诊结核、排除感染、治疗效果），每季度汇总分析解读准确性；

- 定期培训与考核：每半年开展1次解读流程培训，结合典型案例（如肺外结核低序列确诊案例、污染误判案例）强化实操能力；

- 多学科协作（MDT）：对疑难病例（如Ⅰ-Ⅱ级交界病例、免疫低下人群），组织检验科、感染科、呼吸科、放射科联合会诊。

8 注意事项与禁忌

1. 严禁单独以“低序列阳性”出具“结核感染确诊”结论，所有分级判定必须结合临床信息；

2. 避免过度依赖测序结果：MTB培养仍是金标准，测序结果需与传统检测相互印证；

3. 特殊样本处理：对于核酸降解严重的样本（如陈旧组织、凝固血液），低序列可能为假阴性，需在报告中提示；

4. 耐药基因解读：tNGS低序列时，耐药基因检测结果可靠性降低，不建议单独作为耐药判定依据；

5. 伦理要求：报告需保护患者隐私，解读过程中避免向非授权人员泄露患者信息。

9 附件（可直接打印使用）

- 附件1：mNGS/tNGS低序列结核结果解读整合分析表；

- 附件2：低序列结核检测报告模板；

- 附件3：结果随访记录表；

- 附件4：污染排查流程图。