液相色谱仪保留时间漂移原因排查

周宁,

“保留时间是液相色谱定性分析的核心依据，其稳定性直接决定了检测结果的可靠性。实际操作中，保留时间漂移（组分保留时间持续提前/延后、无规律波动）是高频问题，可能导致定性错误、定量失真。其原因可归纳整理为色谱柱、流动相、样品、仪器硬件四大类。”

色谱柱原因

色谱柱是实现样品分离的核心部件，其性能状态与保留时间直接相关，约30%的保留时间漂移问题源于色谱柱本身的异常。

固定相流失反相色谱中最常用的C18、C8等硅胶基质色谱柱，当流动相pH值超出2-8的最佳范围时，硅胶基质会发生水解，导致键合相（如十八烷基硅烷）脱落，固定相总量减少。

随着使用次数增加，固定相对目标组分的保留能力逐渐下降，表现为保留时间持续缩短。

例如，分析碱性化合物时若使用高pH（>8.5）流动相，未进行封端处理的普通C18柱可能在数十次进样后出现明显保留时间漂移，同时伴随柱效下降（峰宽变宽）。

正相色谱柱的固定相（如硅胶、氨基键合相）则易受流动相中水分影响，水分会占据固定相活性位点，降低其对极性组分的保留能力，导致保留时间逐渐缩短。

此外，高温（超过40℃）会加速固定相流失速率，尤其在梯度洗脱中，高比例强洗脱溶剂会加剧键合相脱落。

色谱柱污染样品中的杂质、流动相中的污染物或未完全溶解的组分，会在色谱柱柱头富集形成“污染层”。

相当于在原有固定相基础上增加了新的“次级固定相”，改变了实际分离环境。

轻度污染表现为保留时间缓慢漂移，重度污染则伴随压力升高、峰型拖尾。

例如，分析食品基质中的农药残留时，若样品前处理不彻底，油脂、色素会附着在柱头，导致目标组分保留时间逐针延长。

色谱柱柱头塌陷色谱柱填充不均匀或受到剧烈压力波动时，会发生柱头塌陷，导致流动相流速分布不均，组分在柱内的迁移路径改变，保留时间随之波动。

这种漂移通常伴随基线噪声增大和峰型畸变（如前延峰）。

色谱柱未充分平衡新色谱柱启用前未进行活化，或每次更换流动相后平衡时间不足，是最易被忽视的漂移原因。

新柱内通常填充甲醇或乙腈，与实际分析用流动相存在洗脱强度差异，需通过持续冲洗使固定相与流动相达到热力学平衡。

梯度洗脱后，若未用初始比例流动相充分平衡（通常需10-20个柱体积），柱内残留的强洗脱溶剂会导致后续进样的保留时间偏短，且逐针逐渐恢复正常。

流动相原因

流动相的组成、性质及稳定性直接决定洗脱强度，其微小变化都可能引发保留时间显著漂移，这一因素占漂移问题的40%以上。

流动相组成比例偏差手动配制流动相时，溶剂体积量取误差（如1000mL流动相中西腈比例偏差1%）会直接改变洗脱强度。

反相色谱中，强洗脱溶剂（如乙腈）比例每增加1%，组分保留时间可缩短10%-15%。

即使是二元高压梯度系统，也可能因比例阀磨损、单向阀泄漏导致溶剂混合比例不准确。

例如比例阀响应延迟会使梯度洗脱中实际有机相比例低于设定值，导致保留时间逐渐延长。

溶剂纯度不足劣质甲醇中可能含有微量乙醇或水分，这些杂质会改变流动相的极性；

缓冲盐试剂纯度低时，含有的杂质离子会影响流动相离子强度，尤其在离子对色谱中，离子对试剂浓度的微小变化会显著改变保留行为。

流动相pH值波动对于可解离的酸性或碱性组分，流动相pH值是影响保留时间的关键因素。

当pH值变化接近组分的pKa值（±1范围内）时，组分的解离度会发生剧烈变化，导致保留能力显著改变。

例如，分析苯甲酸（pKa≈4.2）时，流动相pH从4.0升至5.0，苯甲酸解离度增加，与反相柱固定相的疏水作用减弱，保留时间可缩短50%以上。

pH值波动的主要原因：

🔹 缓冲盐配制时pH调节不准确；

🔹 缓冲体系缓冲容量不足（如低浓度乙酸盐缓冲液）；

🔹 流动相放置过程中吸收空气中CO₂（导致pH降低）或挥发（导致pH升高）；

🔹 不同品牌的缓冲盐试剂纯度差异。

流行想温度与挥发性变化温度会影响流动相的黏度和密度，进而改变其洗脱强度。

柱温箱温控不准确时，流动相温度波动会导致保留时间漂移：

温度每升高1℃，反相色谱中组分保留时间通常缩短1%-3%。

即使柱温箱正常，若流动相未与柱温箱达到温度平衡，室温波动（如昼夜温差、空调直吹）也会引发保留时间变化。

具有挥发性的流动相（如甲醇-水、乙腈-水体系）在放置过程中，有机相易挥发导致比例改变。

尤其在敞口溶剂瓶中，室温下乙腈每日挥发量可达1%-2%，导致流动相洗脱强度下降，保留时间逐渐延长。

此外，流动相脱气不彻底时，气泡进入色谱柱会造成局部流速波动，表现为保留时间不规则漂移。

样品原因

样品本身的性质及前处理质量，可能通过影响分离系统状态间接导致保留时间漂移，这一因素常被误判为仪器或流动相问题。

样品基质干扰与污染复杂基质样品（如血清、土壤提取液）中含有的蛋白质、脂质、色素等杂质，会与色谱柱固定相结合，形成不可逆吸附。

这些杂质不仅会占据固定相活性位点，还可能改变固定相表面性质。

例如蛋白质在C18柱上吸附后，会使固定相疏水性降低，导致目标组分保留时间缩短。

这种漂移通常具有累积性，随进样次数增加愈发明显。

若样品中含有与固定相亲和力极强的组分，即使含量极低，也会缓慢占据固定相位点，形成“记忆效应”。

例如分析含长链烷基化合物的样品后，若未充分冲洗色谱柱，残留的长链组分可能导致后续分析中极性组分保留时间延长。

样品溶解性与溶剂效应样品溶剂与流动相洗脱强度差异过大时，会产生“溶剂效应”，导致保留时间不稳定。

例如，用纯乙腈溶解样品，而流动相为乙腈-水（20:80），进样后样品溶液在柱头与流动相混合，局部洗脱强度骤增，目标组分保留时间缩短，且峰型易前延。

若样品溶解性差，未完全溶解的微小颗粒会堵塞色谱柱柱头，导致柱压升高和保留时间漂移。

此外，样品溶液的pH值与流动相差异过大，会改变柱头区域流动相的局部pH值，影响可解离组分的保留行为。

例如，碱性样品用中性溶剂溶解，注入流动相为酸性的系统中，柱头局部pH升高，可能导致组分保留时间一次性偏移后趋于稳定。

仪器硬件原因

仪器核心硬件模块的性能异常，会直接破坏分析系统的稳定性，导致保留时间漂移，这类问题约占15%。

输液系统故障输液系统是维持流动相稳定输送的关键，其故障会直接导致流量波动。

单向阀磨损或污染是最常见原因：阀芯被杂质堵塞或密封圈老化后，会出现“单向阀内漏”，导致实际输出流量低于设定值。

流量每降低0.1mL/min（以1.0mL/min为设定值），反相色谱中组分保留时间可延长10%左右。

高压泵密封垫老化、泵头有气泡或梯度混合器故障，也会导致流量不稳定。

例如，泵密封垫磨损会造成压力波动，压力变化超过5%时，保留时间通常会出现明显漂移；

进样系统异常进样阀阀芯磨损或定量环污染，可能导致进样量不准确，但通常不直接引发保留时间漂移。

然而，若进样阀密封不严出现泄漏，会导致样品在进样过程中被流动相稀释，或出现“交叉污染”：前一样品的残留组分与当前样品共洗脱，可能被误判为保留时间漂移。

自动进样器的进样针定位不准或堵塞，会导致样品无法完全进入定量环，虽主要影响峰面积，但进样过程中引入的气泡可能干扰流动相稳定性，间接导致保留时间波动。

柱温箱与检测器问题柱温箱温控精度不足是常被忽视的硬件因素。

优质柱温箱温控精度应在±0.1℃，若温控偏差超过±0.5℃，会通过改变流动相黏度和组分分配系数影响保留时间。

例如，柱温从30℃升至32℃，反相色谱中弱极性组分保留时间可能缩短5%以上。

检测器本身通常不直接导致保留时间漂移，但检测器流通池堵塞会造成系统背压升高，间接影响流动相流速；

若检测器与色谱柱之间的管路过长或内径不均，会导致组分扩散，虽主要影响峰型，但极端情况下可能造成保留时间轻微偏移。

保留时间漂移排查步骤总结

保留时间漂移的排查需遵循“从简单到复杂、从易排查到高成本”的原则，具体步骤如下：

基础检查：确认系统平衡状态首先观察基线是否平稳，若基线未平，延长平衡时间至15-20个柱体积（新柱或更换流动相后需更长）；

同时检查柱温箱实际温度与设定值是否一致，误差需控制在±0.2℃内。

这是最快速且成本最低的排查环节，可排除80%的基础问题。

流动相排除：验证洗脱环境稳定性配制新的流动相进行对比实验，若漂移消失，说明原流动相存在比例偏差、pH波动或污染；

若问题依旧，检测流动相pH值（与配制记录对比）和脱气状态，观察溶剂瓶中有机相是否有明显挥发。

色谱柱排查：评估核心分离部件更换一根同型号的新色谱柱或已知性能良好的备用柱，若漂移问题解决，说明原色谱柱存在污染、固定相流失或柱头塌陷。

可尝试用强溶剂（如甲醇-乙腈-水=50:50:0）反向冲洗色谱柱进行修复；

若新柱仍出现漂移，排除色谱柱因素。

样品排查：消除基质与溶剂影响进样标准品溶液（用流动相配制），若保留时间稳定，说明问题源于样品基质或溶剂效应。

需优化样品前处理方法（如增加净化步骤）或更换与流动相匹配的样品溶剂；

若标准品仍漂移，可排除样品因素。

硬件深度排查：定位系统故障点监测系统压力曲线，若压力波动超过±2%，重点检查输液系统：

拆卸单向阀超声清洗，更换泵密封垫，排除气泡干扰；

若压力稳定，检查进样阀（更换阀芯或清洗定量环）和柱温箱温控模块（校准温度传感器）；

仍未解决则联系厂家检修高压泵或梯度混合器。

总之，保留时间漂移的本质是“分离系统热力学平衡被破坏”，色谱柱、流动相、样品、仪器硬件四大维度相互关联，排查时需结合实验现象（如漂移方向、是否伴随压力变化、峰型是否异常）精准定位。

日常操作中，规范色谱柱维护（定期冲洗、避免极端pH）、严格流动相配制流程、优化样品前处理、定期校准仪器硬件，才是预防保留时间漂移的根本措施。