备战高考：教材中的“PCR技术”释疑

大庆市高中生物学刘锡凯名师工作室

DNA分子在PCR仪中扩增与在细胞内复制相似，也需要原料、能量、酶、引物、适宜的温度和pH 等，但PCR技术操作中不需要单独提供ATP 作为供能物质．在PCR 技术中，DNA 复制的解旋断裂氢键的能量来自PCR 仪的加热，高温达90℃~ 95℃ 时DNA 分子双链即打开，dNTP的连接能量来源于Taq酶聚合基本单位dNTP加入到延伸链的3'端与上一个核苷酸形成磷酸二酯键时释放一个焦磷酸PPi，焦磷酸不稳定极易水解，释放能量并产生磷酸，这二个反应互相偶联，推动Taq酶聚合单体延伸DNA 分子．

问题2   PCR技术中加入的“引物”是什么?  有什么作用?

引物会在PCR仪中复制吗?

引物是在DNA分子复制时起引导作用一段短RNA或单链DNA片段，可结合在脱氧核苷酸链上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链．细胞内的引物是RNA 链，由RNA 酶根据DNA链碱基序列自动合成。

在PCR技术中，引物是人工合成的两段寡核苷酸链序列，是单链DNA片段．由于DNA聚合酶的特异性和DNA分子两条链的两端的差异性，决定了DNA分子体外扩增时必需设计两种引物，分别与DNA分子两条模板链的两端的感兴趣区域互补，以利于DNA聚合酶由此定向向前延伸，起到很好的引导作用．对于一段需扩增的DNA的核苷酸序列，引物可根据这一序列经计算机设计并合成，使其能有效地扩增模板DNA序列，引物设计的优劣直接关系到PCR技术扩增DNA的成功与否。

引物不会在PCR仪中复制，引物是设计并配比好后加入PCR  仪溶液中的。体外人工设计的引物广泛用于DNA聚合酶链反应(PCR 技术)、测序和探针合成等。

问题3   在PCR技术操作中，加的两种引物在有何特别的要求?

在PCR技术中，引物的设计非常关键，它的长度、特异性等都会影响到DNA扩增效率．设计引物要求做到: ①引物长度一般在 15～30 个碱基之间，这可以保证它的特异性; ②每一个引物中 G + C 含量在 40% ～60% 之间，且比例差异不大，保证操作过程中温度控制同步; ③碱基要随机分布，引物自身不能有连续4 个碱基的互补，防止自身形成发夹式结构，影响扩增效率;④两个引物之间不能有稳定的二聚体或发夹式结构存在;⑤引物不能在别的非目区域引起高效的DNA聚合反应(错配)。

问题4   在 PCR 技术操作中，为何加的引物中 C、G比例越高，退火温度越高?  两个引物中的 G、C比值差异不能太大?

引物的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当引物和互补序列配对为双链DNA分子时的温度．Tm对于设定PCR退火温度是多少必需的参照的值．在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效配对，同时还要足够高，以减少引物与其它非感兴趣的部分进行非特异性结合的配对．合理的退火温度一般在55℃左右，退火温度一般设定比引物的Tm低5℃.设定Tm  值有的是根据引物中G、C 含量估算，确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法，即开始以低于估算的Tm  低5℃ ,  再以2℃为增量，逐渐提高退火温度，较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产生的形成，从而保证了DNA分子延伸过程中的顺利性与正确性．G、C 含量影响退火温度是因为碱基对之间的结合三个氢键，A、T 对之间有两个氢键，打开这些碱基对所需的能量不一样，所以引物中C、G比例越高，退火温度越高．

为获得最佳结果，设计的两个引物应具有近似的Tm值．若由于DNA分子两端序列的特异性而导致引物对的Tm差异较大，为了提高特异性可以根据较高Tm设计的退火温度先进行5 个循环，然后再根据较低Tm值设计的退火温度进行剩余的循环，这可以使得在较为严紧的条件下获得目的模板的部分拷贝．

问题5    为什么细胞内 DNA复制的引物是 RNA?  PCR的引物是 DNA?

细胞内DNA分子复制过程可概括为: 

(1) 双链的解开;

(2)RNA引物的合成; 

(3) DNA 链的延伸; 

(4) 切除RNA引物，填补缺口并连接相邻的DNA片段．迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所发现的DNA聚合酶，都必须有模板链和3'—OH 末端的引物链存在，才能合成新的DNA 链(由5，－3，方向延伸)．这就需要在DNA复制起始阶段由RNA聚合酶首先合成一小段RNA 为引物，RNA引物就提供了这个羟基，DNA聚合酶III才会真正开始DNA链的合成。

在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，合成的RNA 与模板链结合，从而引导DNA分子子链的延伸．而DNA 聚合酶由于它的保真系统决定它不能从头合成DNA单链，所以DNA 复制时先由RNA聚合酶合成一段RNA链，再由DNA聚合酶起到DNA分子复制时的延伸功能，形成互补的子链．

再从DNA分子复制的忠实性看，一般DNA分子两端的碱基对不稳定，因此在合成起始段时，开头的几个碱基如果发生差错将不易校正．为了保证产生高保真的DNA分子就得先延长一个要丢弃的引物，使新加上的碱基严格按照碱基互补配对和上下文的联系，以保证复制的忠实性，即中途配对有差错也会通过酶自动修复．另外，使用RNA 作为合成DNA的引物，主要在于它易被DNA聚合酶III作为DNA合成终止的信号所识别，使DNA聚合酶I进行切口移位，以减少DNA复制的出错率．如果用DNA单链作为引物，则不能被DNA聚合酶III识别，因为DNA、RNA的化学组成不同，从而影响了DNA分子的复制．这有可能是DNA分子复制以RNA为引物的主要原因．

在PCR 仪中用的是DNA引物，是人工设计合成，一般不用RNA 作为引物，因为RNA引物需要被切除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA引物被切除后将使这个新合成的DNA的两端都出现了一段单链而不稳定．

文献出处：

[1]吉祖筠.教材中“PCR技术”中的教学释疑[J].理科考试研究,2016,23(05):94.

来源：追光的人

编辑：彭草

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