康中论坛（第44期）：超声引导下睾丸网位置显微精子吸取术： 精原干细胞移植的新途径

康中会（Cornell-China Circle）

睾丸

移植

精子

我们

患者

组织

干细胞

保存

进行

精原

演讲嘉宾

Kathleen Hwang, MD

Professor of Urology, Department of Urology

University of Pittsburgh

（温馨提示：在文章结尾处，欢迎关注和观看本次演讲的精彩视频）

【本期导读】

第44期《康中论坛》，我们十分荣幸地邀请到了前美国匹兹堡大学医学院泌尿外科及妇产科教授，男性生殖健康主任Kathleen Hwang教授，为我们带来《超声引导下睾丸网位置精子吸取术，精原干细胞移植的新途径》的学术报告。

Kathleen Hwang教授现任美国男性生殖与泌尿学会（SMRU，2024）主席。她也是美国男性生殖研究学会（SSMR，2023）前任主席以及生殖外科医生学会（SRS，2023）前任主席。她曾担任布朗大学医学院男性生殖医学和外科研究项目主任。

她最近已被宾夕法尼亚大学聘为其男性生殖泌尿和男性健康项目的负责人，并将于今年秋天就任其新职位。

她在泌尿和生殖医学领域一直是一位出色的领导者和备受尊敬的专家。其临床研究方向包括男性不育和性功能障碍，研究重点是精子健康的新型生物标志、佩罗尼病的新治疗方式以及男性生育力保护。

• 在本期演讲中，Kathleen Hwang教授首先概要介绍了精子发生的基本过程以及睾丸网的解剖特征；
• 并针对临床上肿瘤患者进行化疗、放疗后常导致患者永久性不孕不育的临床难题，提出了生育力保存一直是男科领域的一个重要研究课题。匹兹堡大学团队一直致力于通过在世界各地的医疗中心建立合作中心，积极保存未成年肿瘤及多种其他疾病患者的睾丸或卵巢组织，从而希望未来的生殖技术可以为这类人群解决生育问题。
• 她在演讲中详细阐述了目前男性生育力保存的三种方法。应用图片展示了超声图像下睾丸网的影像特征，并应用视频详细讲解了超声引导下进行睾丸网注射的操作过程及技术要点，介绍了国际上以及该研究团队在睾丸组织自体移植方面的最新研究进展。该团队在动物实验基础上，积极致力于将睾丸网注射精原干细胞移植技术应用于临床患者，并已经最终实现将一例股骨成骨肉瘤患者的睾丸细胞悬液通过睾丸网注射方法进行了精原干细胞移植。
• Kathleen Hwang教授也详细介绍了匹兹堡大学在世界各地及美国建立的协助中心以及进行睾丸及卵巢组织冻存的现状。最后对生育力保存方面面临的发展难题及研究趋势进行了展望。

再次感谢Kathleen Hwang教授为我们带来的有关精原干细胞移植领域的最新研究信息。

很高兴受《康中论坛》主席李石华教授和《康中论坛》编辑部执行主任周梁教授的邀请担任这次学术交流活动的主持人和导读执笔人。我是一位精原干细胞移植研究领域的“热门爱好者”，因为20余年前自己在北京大学第一医院从事博士后研究时获得的第一项国家自然科学基金青年基金项目就是精原干细胞睾丸网显微注射移植的相关研究，也曾经进行过大量小鼠睾丸网显微注射的实验。因而，有幸聆听Kathleen Hwang教授的演讲，受益良多，获益匪浅。

最后，特别感谢下列8位讨论和点评专家就Kathleen Hwang教授的演讲内容进行了积极提问和热烈讨论。

• 陈慧兴（上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科）
• 赖俊佑（中国医药大学附设医院泌尿科部）
• 麦肇敬（香港仁安医院仁安生殖医学中心)
• 谢 冲（浙江大学医学院附属邵逸夫医院泌尿外科）
• 郭海彬 (河南省人民医院生殖中心)
• 李 朋 (上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科)
• 彭 靖 (北京大学第一医院男科中心)
• 郑裕生 (台湾成功大学医学院泌尿部男性生殖科)

感谢上述点评专家积极分担和参与了本次演讲内容的翻译和编辑工作。

感谢《康中论坛》编辑部执行主任周梁教授在本次演讲前后进行了大量的组织和协调工作。

感谢《康中论坛》主席李石华（Philip S. Li）教授对本期内容的总策划和指导。感谢各位的参与和分享。

李彦锋 教授

贵州医科大学附属医院泌尿外科主任

2024年9月8日于贵阳

今天我的演讲主题是：超声引导下睾丸网位置显微精子吸取术，一种精原干细胞移植的新途径。

这是本次演讲的免责声明和本项目涉及的基金。

众所周知，人类精子发生过程复杂，可分成多个阶段，涉及精原干细胞的诸多分化步骤。所以，临床上帮助非梗阻性无精症患者拥有生物学子代困难重重。

这里简略介绍一下睾丸网，它是睾丸内的一个特殊结构，我们认为从这个部位穿刺进入到睾丸内部吸取并注射细胞，睾丸受到的创伤最小，而且睾丸网的解剖结构，可以通过超声进行观察。

• 面对目前的人口问题，生育力保存一直是男科医师的重要使命之一。针对肿瘤的化疗、放疗以及诸多其他治疗手段均可能导致患者永久性不孕不育，这一点毋庸置疑。
• 成年男女可以提前冻存其卵子、精子或胚胎，以便将来生育子代。遗憾的是，对于青春期前的男孩和女孩来说，因他们还没有产生精子或卵子的能力，上述方法显然行不通。
• 但是，青春期前的男孩睾丸中存在精原干细胞，精原干细胞可以在青春期开始后产生精子。我们团队一直致力于通过世界各地的医疗中心，为男孩保存睾丸组织，为女孩保存卵巢组织，希望并期待未来的生殖技术可以帮助到他们。

我很幸运在匹兹堡大学能和Kyle E Orwig教授一起工作，他是一位著名学者，也是我的至交好友。我们合作开展了许多令人兴奋的研究项目。本次演讲的项目也是其中之一。

这张幻灯展示了他于2021年发表的一篇综述，图片从理论上完美展示和阐述了男性生育力保存的三种方法：

• 第一种方法：获取精子，然后冻存，以便未来通过ICSI获得生物学子代；
• 第二种方法：生精干细胞自体移植。自体移植的关键在于如何将精原干细胞体外扩增，因为通常只能获得很少数量的干细胞，需要找到一种方法来创造更多的干细胞。接受治疗后的睾丸如果没有残存的生精干细胞，那么，再定植的生精干细胞是否能够恢复睾丸的组织结构并恢复生精细胞的数量呢？遗憾的是，30年来，基于生精细胞的这些尝试均未能获得足够的效率并达到安全的阶段，这也限制了其临床应用；
• 第三种方法：依赖于不成熟组织的发育潜能。这也是我们所关注的课题，即未成熟睾丸组织的生精能力。我们将新鲜睾丸组织的小碎片进行冷冻保存，以便于未来可以移植回自身或宿主的皮下。

我们聚焦于红框标出的这两种可能的方法。我们回顾总结了历史文献以及前辈们取得的成果。

这是一张标志性的图片，所有对此有过认识或看过关于精原干细胞示意图的学者，都对它非常的熟悉。

图片来自于1994年Brensster博士的实验室，我想表达的是：在很久之前，当前辈们观察到睾丸的这个潜能时，他们就开创了这个新的引人注目的移植方法。因此，这篇被誉为最优秀的生物学论文，阐述了干细胞独特的生物学原理。当我还是住院医生的时候，便对此很着迷，并促使我投身于这个领域。通过这个方法可以追踪干细胞，这很神奇。

下面我将向各位展示，作为贝勒医学院的一名研究员所做的一项工作，应用鼠睾丸，测试将微管注射到睾丸网内是否可行？

我给你们看一段视频，显然这是我进行了上千次尝试后最好的一次。我正在注射亚甲蓝溶液，我想看看是否真的能以一种无创伤的方式渗入，结果真的填满了那些曲细精管，所以我真的很兴奋。这促使我开始思考，如何能够以一种相对无创伤的方式穿刺进入睾丸网内。

• 超声引导下的睾丸网注射是一个完全与众不同的概念，它仍然是一种微创技术，是由超声引导进行的。

这是一个经皮穿刺针，可以进入睾丸网。超声波图像上这些增强的白色条纹就是睾丸网。

这实际上是一只猴子的睾丸。

• 我想向你们展示的是当我们注射进入正确的位置时，你们可以看到针头进入睾丸网，溶液中加入了超声造影用的微泡，所以你可以通过超声波上的白色回声来识别溶液。
• 一旦我们进入了睾丸内，你就必须确保你处于正确的间隙内，而不会注射于间质组织内。
• 一旦进入恰当的间隙，你会看到美丽的白色亮光，表明我们确实注射进入了睾丸网。

• 如果你进一步观察，超声波上的白色溶液就会进入到曲细精管中。
• 因此，这是一个非常令人兴奋的时刻，我们了解到这是一种有潜力的注射方式。这是一个猴子的睾丸。

我们考虑是否可以在青少年或年轻的成人中采用相同的方案？

上述图像是静态超声波图像，这是由波士顿一家儿童医院的医生提供的一名16岁和17岁的男孩的影像，你可以再次清楚地看到睾丸网。

因此，从理论上讲，在人类和患者身上开展该项技术上是可行的，而这正是我们的目标所在。

如果我们讨论精原干细胞移植是否已经可以用于临床？我们认为已经一切准备就绪。这项技术已经成熟并且在很多不同的物种身上试验过。

• 在匹兹堡，Orwig博士从2011年起，就开始收集这些组织样本，现在大概有1000多例患者。我第一次做这一研究的时候就已经有大约800例患者，之后它又增加了不少。当我了解到很早以前就已经有干细胞移植于人体内的临床应用时，我感到十分震惊。
• 1999年，当时有一篇快速发表的文章，指出对12例何杰金病患者进行了特定细胞悬液的冷冻保存。2001年和2003年时，作者在其中7例患者身上进行回注移植。那个时期由于技术不够成熟，并没有在大型动物物种中实施该类研究的报道，我们也没有追踪到这7例患者的后续结果。但令人难以置信的是，这是在2000年就已经完成的事情。

现在我们再回过头来，上述图片所展示的是我们正在尝试去解决的问题，就是应用非成熟的睾丸组织进行自体移植和异种移植，然后观察其随后恢复产生精子的过程。

这是一项早在2019年就发表的研究，但这的确是一个极为神奇的故事。

• 这项来自卡尔实验室的研究在关于非成熟睾丸组织自体移植方法方面存在两项主要突破：首先，他们描述了一种经过改良的自体移植技术，通过这项技术移植物的回收率接近100%。研究从实验动物开始，从切除的睾丸上取一部分组织进行活检，取出的睾丸组织进行冷冻保存，动物接受化疗后，再将睾丸组织移植回去；
• 第二，作者使用的是大块的组织碎片，进行重新聚集，我将一步一步逐步向你们展示他们是如何产生这种神奇结果的。

• 如果考虑使用青春期前的睾丸组织进行自体移植，就会选择不同的移植部位进行尝试，了解哪种移植类型的移植环境会更加成功，如何使受者获益。
• 正如我们谈到的那样，动物受者是接受过化疗，或被切除睾丸的恒河猴，而要移植地方的皮肤也先被部分切开(如上图背部及阴囊的位置)。移植位置选择背部皮下六个不同的部位，另外两个移植部位在阴囊皮肤下，每个部位移植四块组织。再次强调实验动物的睾丸已被切除，但是其阴囊皮下可以进行移植。
• 该实验对比观察了新鲜与冷冻组织的数据，背部与阴囊皮下移植部位的结果，以及是否与移植部位基质融合等情况。

上图是正常成年恒河猴的睾丸，经减数分裂后的生殖细胞组织学染色。

红色是生殖细胞，绿色是减数分裂后的生殖细胞。

右下图中暗色的部分是细胞核的染色。组织结构经过染色，我们可以看的相当清楚。这是相对正常的成年恒河猴睾丸图像。

上图为经化疗后，移植前的恒河猴未成熟的睾丸组织的染色图像，你可以看到里面的细胞非常稀少。上图红色的部份是我们仍观察到的为数不多的生殖细胞，但并没有减数分裂后的生殖细胞。

我们可以通过检测这些动物进行睾丸组织移植后的睾酮水平，来观察这些动物的睾酮在4-6个月内的变化。

红色箭头的时间点，就是进行移植的时间，我们可以看到在移植后睾酮就立即有显著上升，且至少持续6个月以上的时间。

我们来看看移植后到底发生了什么事情？移植本身非常成功，现在我们重点来看一下右图，在阴囊皮下被移植进去的小睾丸显而易见。

通过此实验，我们可以观察到不同部位新鲜与冷冻的移植物不同的生长状况。

上图是移植物被移除时的标本，大约是移植后8-12个月的时间。

令人惊讶的是，在被放大的图片上我们可以看到其曲细精管看起来与正常的睾丸组织几乎是一模一样的。

此外，我们从左侧组织学的染色证实，自体移植物也显示出完整的生精功能。此外，从右边的图片也可以看到明显的精子。根据研究显示，82%的自体移植物可以实现如上图所示的完整生精功能。

我们可以继续讨论移植在背部或阴囊皮下的移植物，哪种部位效果更佳，但那并不是重点。重点是，通过这些得来不易的精子做ICSI，得到胚胎后再植入母体，通过此方法，我们最后获得了确切怀孕的案例。而这是第一例通过该方式成功受孕的例子。

该图显示通过超声波来检测怀孕的状态。

名叫Grady(Graft-derived baby)的小猴子在2018年8月16日诞生了，而她是世界上第一个通过自体移植、冷冻和解冻的睾丸组织生下的非人类灵长类子代。

她到现在仍然生活在美国奥勒冈州。右图为简单的影片，Grady正快乐的与她的阿姨玩耍。

随着她年纪渐长，研究人员确认成年后，Grady是具有生育能力的。

所以关于干细胞的冷冻保存以及移植，是否具有确切的未来呢？

我认为答案是肯定的。

从2019年此类研究被发表之后(虽然只有一篇)，如果认为睾丸组织的移植是可行的，那么，我们的下一步该做什么？

• 我们计划应该继续在具有类似环境下的动物身上重复实验。
• 希望能够将此模型套用在青春期前患有癌症的儿童身上。

这是我们同一团队在2021年所发表的另一篇文章，探讨青春期后精原干细胞在恒河猴上的移植，是否能够让在青春期前后接受辐射的恒河猴进一步恢复生育能力。

共有六只青春期前准备”被”移植的猴子，一开始都将一侧的睾丸组织取下做冷冻保存。按照图中所示的时间线，先经过第一次辐照后，再过14个月等青春期发育后，进行第二次辐照。从实验第64周开始，定时进行睾丸大小检测，精液检查，且在经过两剂的GnRH抑制剂应用后，于实验第72周时，将之前取下的睾丸组织移植回去。

这是一个旷日持久的实验，我特别在第106周的时间点打了一个星号的原因是因为我从那时候才正式加入匹兹堡大学团队。

我认识Dr. Kyle Orwig已经很久了，我们此前就曾讨论过让我加入这个课题的话题。实验动物被安置在德克萨斯州休斯顿，我们在那里一同做了所有注射、移植实验。

这张表格的内容有点多，我想让大家关注的是这六只猴子分别被注射进去的细胞数量，大多数在四千万个上下。

可以设想，到底需要多少细胞，才有可能会移植成功？

这是超声引导下进行睾丸网注射的影像，只是一个简短的视频，与前面展示的视频相同。

溶液中含有亚甲蓝，我们希望病理检查时可直观地看见溶液在睾丸内分布的具体位置。

细胞注射液中含有亚甲蓝以及微泡，可以用超声波对溶液进行示踪。

然后，将实验动物睾丸切除进行如下的实验。将睾丸横向切开，几乎可以看到亚甲蓝溶液呈星形图案，分散在睾丸横截面，我们认为细胞溶液就是以这样的方式进入到睾丸的各部分。

我们看一下非人灵长类动物的实验数据。

• 这六个不同的实验动物在显微注射实验之前证实均为无精子症。
• 通过对实验动物多次射出的精液进行分析，证实精液中无精子。
• 实验动物年龄均相似。移植后研究结果显示的是，通过睾丸网穿刺所获取的精子总数。
• 6只实验动物中有4只在睾丸网穿刺中发现精子，然而在术前他们是无精子症，这让我们非常兴奋。

我们将所有的图像保存数月，这是睾丸网穿刺取精复苏一天的图像，我们可以看到精子，它的尾巴有一些摆动，这非常令人兴奋。

我们利用所获取的精子进行了卵胞浆内单精子显微注射（ICSI），并培养到了伦理学允许的阶段，然而我们没有得到胎儿，这有点令人失望，但我们仍然得到了发育良好的致密桑椹胚。左上方图像就是我们看到的精子。

然后我们回到前面：下一步怎么做？

• 如果睾丸组织移植是可行的，我们认为可以建立一个模型，模拟青春期前肿瘤患者的治疗模式。

• 然而在人体研究的可行性如何？
• 我们如何证明在人体研究中的安全性呢？

我们再回到这张图片，我们讨论了睾丸网显微注射是可行的。

• 理论上不育夫妇的睾丸组织，可能通过培养，重新注射到不育的睾丸中。
• 理想的结果是，随时间推移，理论上这对夫妇就可以怀孕了。Grady就是睾丸组织移植的一个成功的案例，在不同的疾病情况下，通过提取睾丸组织，尤其是自身睾丸组织进行自体移植，然后体内完成精子发生过程产生成熟精子。
• 理论上还需要通过睾丸取精获得精子，利用辅助生殖技术生育子代。

• 因此，在人类中进行研究的话，首先就像机构审查委员会对待其他涉及人类的研究一样，你需要证明睾丸网显微注射技术是可行的、可重复的，大多数情况下是安全的。

我们进行了睾丸网精子抽吸的研究。我们必须考虑哪些患者会愿意在他们的睾丸里插一根针来接受检查，评估这种睾丸技术是否真的安全。

• 我们很快就确定了无精子症患者是一个很好的目标人群，他们没有精子，所以他们非常渴望我们用一种微创的方法进行检测。我们在这种情况下是否能找到精子呢？
• 这群不育症患者既包括存在生精功能障碍的非梗阻无精子症患者，也有因生殖管道问题导致的梗阻性无精子症患者
• 。我们对于参与这项研究的患者，将其诊疗方案与标准治疗流程相结合。
• 因此，患有非梗阻性无精症的患者可以选择在显微取精之前进行这项研究，梗阻性无精症患者可以选择在找不到精子的情况下进行这项研究，或者用其他任何类型的精子抽吸方法来获取精子，以便后续进行IVF周期。

我们选取了8个不同的成年患者，他们都非常愿意进行试验。

• 我们选择了5例非梗阻性无精症患者，因为它更类似于癌症治疗后的患者群体，他们睾丸内很可能是无精子的。
• 我们希望在睾丸较小的患者，更多病理学问题的患者中进行尝试。我们选择了有梗阻性问题的患者，因为这些患者有精子。
• 这将是一个概念验证，即如果我们进入正确的空间，我们就有能力抽吸精子并确认。
• 所以，我们总是在选择患者，选择患者，选择患者。很是花了一段时间才找到合适的患者。

这里有一个非常繁琐的表格，我们的结论是有8名患者，其中三名是梗阻性，就像我们讨论过的那样。5名非梗阻性，以下这些是要点。

在5例非梗阻性无精子症患者中，睾丸网抽吸没有发现精子。我们能够表明我们进入了睾丸网并进行了抽吸，但没有精子。其中3例患者选择将睾丸网抽吸与睾丸显微取精相结合进行，其中1名患者在显微睾丸取精中发现了精子并进行了冷冻保存。3例梗阻性无精子症患者，均选择将睾丸网抽吸与睾丸取精相结合进行。所有三名患者在睾丸网的抽吸中均获得精子，精子被冷冻保存于多个不同的样本管中。

最重要的是，这些患者没有出现任何不良反应。他们均在几天内康复，尤其是那些显然只进行睾丸网抽吸的患者。因为这种操作没有出现不良影响，所以，伦理审查委员会对此非常满意。

这是一些患者的超声图像。其中一位是33岁的患者，是一位非梗阻性无精子症患者，未找到精子。这是影像上所显示的睾丸网。另一位是31岁的非梗阻性无精子症患者，仅通过显微取精发现了精子，并进行了三管冷冻保存。再次，您可以看到睾丸网。

不过我可以告诉您，超声下寻找睾丸网具有一定挑战性。

您必须花费许多时间来找到正确的平面，以便能够在超声波上看到较年长的成年患者的睾丸网。

我们与小儿泌尿科团队合作，从而能够更容易地在青少年、刚刚成年的男性及二十多岁的年龄组中确定睾丸网。

我们努力寻找正确年龄组作未来潜在移植的研究。虽然在三十多岁的人群中确定睾丸网是可行的，我们也已经展示了其图像，但这并不容易。我需要花费更多时间找到正确的平面，以便能够看到整个组织中的睾丸网。

我想花一点时间与大家在此分享一下我在匹兹堡大学的生育力保存计划。

• 这项工作自2011年以来一直在进行。这里显示的是我们的老数据，大约有八百多个睾丸组织样本。
• 我认为目前我们大约有九百五十个样本被冷冻保存。这里显示的是接近400个卵巢组织，目前我们应该有大约四百五十个女性样本。
• 我们的使命非常明确，我们希望成为患者教育者和服务提供者。我们希望为他们提供生育力保存的选项。开拓新技术并将其转化为临床应用。
• 我们希望培养下一代生育力保存专家。通过获得良好的资助，我们在匹兹堡已经建立了一个致力于生育力保存的完整团队，包括护士协调员、实验室协调员。
• 我们在2018年加入UPMC时，实际上创建了一个中心。这个中心是生殖与移植中心。
• 虽然它是一个临床的男性生殖学中心，但我们有50%的努力也致力于进行科学研究。这非常独特，我们对此感到非常自豪。

从睾丸组织冷冻的角度来看，青春期前组织和青春期后成年组织所需的保存方案是不同的。

因此，匹兹堡的团队创建了他们认为是最有效的组织冷冻技术。

这是关于我们在匹兹堡项目中成人组织冷冻的整体概览。

本图可以看到，通过这一研究协议选择进行组织冷冻保存的患者，有很大一部分是非癌症患者。有性别认同障碍患者群体，还有大部分来自骨髓血液学领域的非癌症患者。逻辑上讲，它们也正是我们在针对所有不同癌症患者进行研究基础上的一个突破点。

这是生殖和移植中心所有的团队成员，包括实验室主任、实验室管理者和研究者，这些人日复一日，只关注生育力保存。Kyle Orwick是中心主任，也是我的领导。我是心理健康中心的主任。这项事业需要很多人，需要很多敬业且真正热衷生育力保护的人。 关于我们的国内和国际影响力。实际上，我们在全国和世界各地都有合作中心。不同地方的机构与我们合作，为我们发送组织标本。在美国共有 34 个合作中心，因此，我们每天都会从美国的不同中心获得组织标本。

这张放大的地图更有针对性，以便能够向您展示美国各地合作中心的分布情况。

这是一个正在进行的过程，我们现在的目标是要弄清楚，我们有没有办法移植生精干细胞？

我们能否利用这种真正最有效的技术来重新移植多年前保存的生精干细胞？

所以我们花了很长时间为患者编写IRB，我们花更长的时间来与患者讨论选择。真的准备好移植给患者吗？这真的足够安全吗？

我们现在有三个目标：

• 第一个目标是寻找一个潜在的本地候选人，靠近匹兹堡，这样他们更容易监测，更容易沟通，不需要太多的旅行来协调沟通等。我刚刚向你们展示了我们的合作中心遍布全球。
• 我们的第二个目标是找到一个没有癌症的病人。我们想要一个没有患癌症的人，因为这一直是我们关心的问题，不想候选者在癌症治愈后重新注入任何潜在的恶性物质。
• 我们曾希望找到一个既有细胞悬液又有冷冻保存睾丸组织的受试者，所以协议多年来一直在变化。一开始只有细胞悬液，所有的组织都被处理了，细胞悬液能很快地保存。然后团队在特定的时间内决定进行组织冷冻保存，就像特定组织移植一样。因此他们切换了协议，如果同时拥有细胞悬液和睾丸组织的先保存睾丸组织。

然后，我们必须讨论所有可能的问题：

• 如何在一段时间内与合作中心的人员协调工作，你有可能要随访他们1-2年；
• 讨论了理论上注射干细胞进入睾丸到产生成熟的精子需要多长时间。
• 然后是实验室优化。这大概是最大的难点，要了解用最准确的方法把细胞悬液制备出来，然后再处理。
• 然后具体规划好把细胞悬液植入到哪个部位最好：是再次将其植入阴囊皮下，还是将其植入在具有更好血管床的特定区域里。

经过多次讨论，我们最终确定近 70 名候选人进行评估，他们满足3个条件：当地的候选者；没有癌症；同时都有细胞悬液和冷冻的睾丸组织。

如果他愿意参加睾丸组织保存，这是生育力保存流程。

从2011 年，还是哪一年开始每年都会更新一次。我们的工作人员会打电话给他，检查他的治疗过程、他的癌症生存情况，并衡量他对生育等方面的兴趣，我们与他的父母交谈，与正在发育中的孩子交谈，所以我们有所有这些患者的非常好的更新信息。

这是我们制定的研究流程，经历了许多次修改，最终得到了批准，我们选择了我们的第一位患者。我们与各种伦理委员会，包括我们的实验室委员会、中心委员会、我们部门委员会、泌尿外科、以及我们内部之间的大量沟通。

我们最终确定了第一位患者，这位患者在11岁时诊断为成骨肉瘤。

请记住我告诉过你，我们有三个目标：我们想要一个匹兹堡本地人，我们想要一个没有癌症的人，我们想要一个同时有细胞悬液和睾丸组织的人。我们显然未能实现所有这三个目标。

我们选中了一位患者，他是一位癌症幸存者、曾患股骨成骨肉瘤。2010年，在其11岁时进行了保留肢体（远端股骨）的手术并接受了化疗。2011年，他决定参加 UMPC 的生育研究并来到UPMC进行了睾丸活检。而目前他已经是二十多岁了。由于其患病的经历，从其个人角度，他对生殖健康很感兴趣。我们同他和他的家人进行了多次深入沟通，他们都很渴望成为我们研究的一部分。我们花了六个月的时间和他本人、他的肿瘤科专家、心脏病专家以及他的所有医生进行沟通，以确定他就是正确的人选。经过长时间多次沟通，我们最终确定他就是第一个合适的患者。

因此，在2023年11月8日，他被安排通过睾丸网注射方法进行了精原干细胞移植。这一步已经完成了。

我们也同他当地的医生确认过，他有至少两份穿刺标本被确定无精。他当时在本地的检查还证实双侧睾丸体积约为8ml。他最初是进行的左侧睾丸活检。他很渴望参与研究，他的全家也都来到匹兹堡参与了整个研究过程。

这里显示的是他之前接受的治疗。你可以看到他接受的化疗剂量。你还可以看到我们收到的穿刺组织的数量。这些数据显示了不同的合作中心穿刺出的睾丸组织量差别巨大。

有些标本非常非常小，然而，另外一些标本几乎是整个睾丸。当我们与合作中心交流时，根据我们的流程，我们建议合作者提供的组织约占整个睾丸大小的25%。

我们对具体的标本重量没有要求，这取决于患者的年龄和睾丸的实际大小，只要是实际睾丸体积的25%就可以。因此，我们希望得到1/4睾丸体积大小的标本组织。

你可以看到从这个患者，我们得到的细胞总量是比较多的，他们被分成两人份保存，所以他有两管细胞悬液，活力都非常好。

在冷冻之前，对穿刺组织进行免疫组化染色，你可以看到非常大量的细胞。因此，我可以告诉你们的是，当我们决定进一步进行真正的注射时，我们需要确定好怎样合作才能把细胞注入患者体内，以及我们怎样处理这些细胞悬液。

这就是我们和患者在手术室做睾丸超声检测。我很高兴我可以识别这些睾丸超声图像。普通的超声检测仪不能用来检测睾丸网。

这项技术其中最具挑战性的是如何妥善地固定睾丸并进行穿刺和注射？

• 我们最开始在动物模型和猴子模型中尝试这样做时，当时房间里大约有十二个人。整个过程人员太多，操作台上的手也太多。其中一个人固定住睾丸，并且持续稳定地维持阴囊皮肤的张力。第二个人操作超声波探头，第三个人进行实际注射。需要有第四个人或更多人参与进行细胞监测和其他步骤。因此，这技术是需要团队合作才能达成的。
• 我们希望找到一种更少人参与的有效的操作方法。因为每次操作都让10多个人参与不太可行。我们通过不断的实践和练习，我们最终确定了只有两个人参与的流程。一个人帮助保持睾丸稳定，我们实际上在睾丸下方使用升主动脉夹钳让阴囊皮肤绷紧。这并不是创伤性的，之后皮肤仍是完好的，这种方式可以提供睾丸良好的稳定性。此时病人仅接受静脉注射，在麻醉监控下维持温和的镇静状态(MAC sedation)。然后我就是第二个人，是负责操作超声波探头，也是负责注射的人。

这里的重点是你只有少量细胞，你必须想出如何将其装入相对较大的针管中，且相对于使用PBS或其他溶液，如何成功让这些细胞注入睾丸网中。

另一个挑战是我们在影像下如何确定注射的准确位置？

• 在动物模型中使用的是超声微泡。超声微泡的神奇之处是在超声波影像上非常容易辨认。但由于这种人工方式制造的微泡，没有对人类睾丸的安全性进行过测试，因此我们实际上只是像心脏科进行心脏超声波检查一样，利用单纯的搅拌产生小泡，只需对溶液进行搅拌即可。我们用细胞溶液进行了这种练习，以确保不会对细胞造成创伤，结果是可行的。
• 整个过程如图所示，我们会预灌入一点空气，所以在放入的时候你可以看到一点白色在超声波上，紧接着是150μl的细胞溶液，然后是200-300μl的PBS，最后再灌一点小气泡。这样，你有一个小缓冲区，能判断什么时候可以停止注射。我们非常努力地尝试灌注这些细胞，整个过程都在超声影像监测下进行。因此你知道何时完全将细胞注入正确的位置。
• 提醒一下，因为这是小的睾丸，我们使用的针头是25 号（外径0.51mm）。我们测试过这样小的针头不会对注射的细胞本身产生破坏。

我们后来选择只用一瓶细胞悬液的注射量，这是我们与患者与家人充分讨论后达成的协议。病人真的很想成为首位成功的患者，我们最终得到了大约940万个细胞。解冻后细胞生存比率约可达到73％，这其实是不错的结果。

这是团队的所有成员。我前面说过，我不可能带14个人在房间里，但是我们关系很紧密，这些都是我们重要的团队成员。

麻醉医师Orwig与我们一起。一些是实验室成员、博士后研究员。很多了不起的人，我真的很高兴能加入这个团队。

回顾一下，我们已经准备好在临床上应用该项技术。但是，仍然有很多要确定的东西。

• 我们仍有许多知识上的缺口需要填补。
• 当然，自体睾丸干细胞和睾丸组织移植方法可能已经准备好使用至人类临床治疗上，但并非绝对适合所有患者，就像你很难决定何时可以将先前患有特定癌症或血液疾病的患者的细胞重新注入体内。
• 在性别认同障碍患者中我们也面临很大挑战，因为他们可能正在服用雌性激素，而我真正着迷和思考的是如何在特定环境中使这些睾丸组织成熟，无论是异种移植到动物宿主、还是睾丸组织器官培养的方法。
• 然后，最有趣的部分是如何从培养皿中将皮肤细胞培养产生出精子，这些将是非常令人期待的。

这里再跟大家报告一下，这位在去年11 月治疗的患者，目前恢复良好，他在术后六个月时进行了第一次精液分析，没有发现精子，但接下来的三个月内他又会再进行另一次精液分析。

他的激素分泌完全正常，没有创伤。他康复得很好，并且对自己参与其中感到非常高兴，但针对后续生育力是否能够恢复？到目前为止还在随访中。这就是我们即将发表的研究成果，我很高兴能在今天与大家分享。

最后，我想再次感谢大家的邀约。这是我和（李石华）Philip Li教授 最近在我们学会董事会议上(ASRM-SMRU)的合影。

我非常感激能够与大家分享我的研究，我很乐意回答任何问题。

【编者后述】

非常荣幸邀请到我的好朋友，前美国匹兹堡大学医学院男性生殖健康中心主任、泌尿科、妇产科和生殖科学的Kathleen Hwang教授，担任《康中论坛》第44期的特邀嘉宾。我也非常高兴利用今年八月在北京出差期间，特别在线上向中国的泌尿男科和生殖医学界同道介绍这位杰出的美国医生-科学家。Hwang教授的演讲主题是：“超声引导下睾丸网（rete testis）位置显微精子吸取术：精原干细胞移植的新途径”。

Hwang教授将于今年秋季加入美国宾夕法尼亚大学，担任泌尿外科教授及男性生殖泌尿科和男性健康中心主任。

Hwang教授目前是美国男性生殖和泌尿科协会（SMRU, 2024-2024）的主席，并曾担任美国男性生殖研究协会（SSMR,2022- 2023）和美国生殖外科医生协会（SRS, 2022-2023）的主席。她还曾是布朗大学医学院男性生殖医学和外科研究项目主任，并担任外科（泌尿科）副教授。Hwang教授在纽约医学院获得医学学位后，在弗吉尼亚大学完成泌尿外科住院医师培训。2011年，她在贝勒医学院完成男性生殖医学和外科专科培训。

她是泌尿外科和生殖医学领域一位出色的领导者。她的临床兴趣包括男性不育和男性性功能障碍；她的研究重点是精子健康的生物标志物、佩罗尼氏病的新治疗方式以及各个年龄段的男性生育能力保存。

她是一位非常受人尊敬的医师-科学家。她致力于推动泌尿生殖和男科学教育、培训和学科发展，发表了数百篇具有高影响力的同行评审临床和基础研究论文和专著。她是许多年轻泌尿科医生学习的榜样，她在教学和培训下一代泌尿生殖和男科专业人士的贡献得到了ASRM和AUA的高度认可。成为众多年轻泌尿科医生学习的楷模。

• 本期论坛的主持人和导读撰稿人是贵州医科大学附属医院泌尿外科主任李彦锋教授。他在该领域也是国内的佼佼者。
• 《康中论坛》八位特邀点评专家（按姓氏拼音排序）：陈慧兴（上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科），郭海彬（河南省人民医院生殖中心），赖俊佑（中国医药大学附设医院泌尿科部），麦肇敬（香港仁安医院仁安生殖医学中心），李朋（上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科），彭靖（北京大学第一医院男科中心），谢冲（浙江大学医学院附属邵逸夫医院泌尿外科），郑裕生（台湾成功大学医学院泌尿部男性生殖科）。感谢他们为此次学术交流会提供了大量的资料翻译和文字编辑支持。

特别感谢《康中论坛》编辑部执行主任@周梁教授在幕前幕后所做的卓越贡献，以及康中会执行主席@周任远教授对本次学术交流的全程督导。

李石华 （Philip S. Li)

2024/9/8 清晨5:30 分

美国、纽约、长岛

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《康中论坛》第44期 2024

本期论坛主持人/导读执笔人

李彦锋

讨论专家、资料翻译专家

（按翻译时段排序）

陈慧兴、郭海彬、赖俊佑、李朋

麦肇敬、彭靖、谢冲、郑裕生

本期视频录制/编辑

周 梁

本期责任编辑/审校

李彦锋、周梁、李石华 (Philip S. Li)

本期论坛策划/终审

李石华 (Philip S. Li)

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