康中论坛（第43期）：低温生物学与生育力保存 细胞-组织-器官冷冻保存与移植系列研究

康中会（Cornell-China Circle）

冷冻

保存

卵巢

生育力

移植

教授

器官

低温

复温

研究

演讲嘉宾

王 翔

泌尿外科学教授 主任医师 博士生导师

上海交通大学医学院附属第一人民医院

泌尿外科临床医学中心副主任

泌尿肿瘤科主任

（温馨提示：在文章结尾处，欢迎关注和观看本次演讲的精彩视频）

【本期导读】

《康中论坛》第43期很荣幸邀请到上海交通大学医学院附属第一人民医院泌尿外科临床医学中心副主任、泌尿肿瘤科主任、主任医师、博士生导师王翔教授，主讲“低温生物学与生育力保存：细胞-组织-器官冷冻保存与移植系列研究”。

王翔教授曾任复旦大学附属华山医院泌尿外科教授和复旦大学泌尿外科研究所副所长，在加拿大蒙特利尔大学和麦吉尔大学完成博士后研究，并曾作为访问学者在美国肯塔基大学和克利夫兰医学中心深造，在美国康奈尔大学医学院男性生殖医学与显微外科中心作访问教授。

现任上海市医学会男科学分会主任委员、上海市医学会泌尿外科分会委员、中华医学会男科学分会委员、中华医学会泌尿外科学分会基层学组副组长、中国抗癌协会肿瘤光动力治疗专委会常委、国家科技奖励评审专家。他还荣获了上海市科技启明星、教育部跨世纪优秀人才、上海市卫生系统银蛇奖、2023年度十大医学促进专家、2024上海医学科技一等奖等多项荣誉。主持5项国家自然科学基金项目和1项科技部973子课题，发表50多篇SCI论文（包括Nature, Human Reproduction, Fertility and Sterility, EMBO, Int J Surg等期刊），参编12部教材和专著。

• 他是一位受人尊敬的医生·科学家，擅长各种泌尿系肿瘤及男科疾病的微创手术与综合治疗。
• 王翔教授的主要临床和基础研究方向是低温生物学与生育力保存以及泌尿系肿瘤的分子机制与转化。
• 他是国内乃至国际早期进行生育力保存研究的先行者，在2002年就曾以第一作者在Nature杂志上发表研究论文，多年来取得的成绩大家有目共睹。

初次认识王翔教授是我在康奈尔大学医学院访学期间，恰逢他应李石华教授的邀请来康奈尔大学医学院学术交流，并进行精囊镜临床手术方面的学术交流，精彩报告展现了一名出色的中国临床医学专家科学严谨的诊疗理念、精准的手术规划及操作，给在场学者们留下了非常深刻的印象。

因为我早期在研究生期间也从事器官冷冻保存方面的研究，先前就获悉王翔教授在生育力保存与器官移植方面有极深厚的造诣，没想到他的外科手术功底也同样令人敬佩。回国后我们之间多次探讨生育力保存器官移植方面的相关问题，总令我获益匪浅，在生活中他更像是一位亲切温暖的兄长，王翔教授无论做人做事做学问方面都是我学习的榜样！

青春期前肿瘤患儿的生育力保存是目前国内外学者关注的前沿难题，此次王翔教授系统介绍了他带领的研究团队在完整性腺器官（卵巢和睾丸）、精原干细胞和卵巢组织冷冻保存与移植领域进行的开拓性探索和研究成果，从细胞-组织-器官三个层面阐述了低温生物学技术在生育力保存上的应用价值和存在问题，并指出生物样本复温过程中内外温差造成的冰晶重结晶依然是目前尚未解决的难点，相信随着对低温生物学理论知识的深入掌握和冷冻复温技术方案的不断创新（如生物材料和纳米技术的应用等），生育力保存相关难题终将取得突破。

点评环节各位专家各抒己见，针对这一热点领域展开激烈讨论，学术气氛浓烈，给参会学者们留下深刻印象。

再次感谢王翔教授为我们带来的精彩演讲。同时也感谢各位特邀点评专家：

• 浙江大学附属第一医院泌尿外科方丹波教授；
• 西安交通大学第二附属医院泌尿外科李和程教授；
• 四川大学华西医院柳良仁教授；
• 华中科技大学附属同济医院王涛、蓝儒竹教授；
• 天津医科大学总医院刘晓强教授；
• 海南省人民医院泌尿外科王为服教授；
• 温州医科大学附属第一医院武志刚教授。

感谢《康中论坛》编辑部执行主任周梁教授。感谢康中会执行主席周任远教授的全程督导！感谢《康中论坛》主席李石华教授策划本期学术活动！

潘 峰

华中科技大学同济医学院

附属协和医泌尿外科 主任医师

2024年8月16日 于武汉

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感谢会议支持人潘峰教授对我的介绍。尊敬的李石华教授、康中会周任远主席、各位康中会的会友朋友们，大家晚上好！

我今天汇报的内容是关于低温生物学和生育力保存，是把我二十多年来所做的有关细胞、组织、器官冷冻和保存和移植的系列研究向大家做一个简要介绍。

近年来生育力保存研究是一个热门研究领域。很多男科医生也投入到生育力保存方面的研究。

• 我本人1999年博士毕业后，留在上海华山医院从事泌尿外科和肾移植临床工作。
• 2000年，我到了加拿大蒙特利亚大学CHUM医学中心做博士后研究，最初是从事显微外科和器官移植方面的实验研究。
• 2000年冬天，在蒙特利尔的一次学术交流会上，经陈惠方教授引荐，我有幸认识加拿大麦吉尔大学皇家维多利亚医院生殖医学中心的Roger Gosden教授。Gosden教授主要从事女性生育力保存方面的研究，当时是卵巢组织冷冻保存领域的国际著名科学家。我当时给他提起完整卵巢性腺器官冷冻保存的设想，Gosden教授觉得非常有意义，一拍即合，我们就一起合作研究了大半年时间。
• 2002年初从加拿大回国，回到华山医泌尿外科，
• 2016年又被引进到上海交大医学院附属第一人民医院。

其间二十多年时间里，我在低温生物学领域的细胞、组织和器官冷冻保存与移植方面做了一系列研究。除了最早在加拿大蒙特利尔与Gosden教授合作研究完整卵巢性腺器官冷冻保存外，回国后我申请到国家自然科学基金和上海市科委基金课题资助，并招募了复旦大学附属妇产科医院的几位博士研究生和硕士研究生加入到我的研究团队。

• 2011年，有幸参加了乔杰教授的科技部973 项目——雌性生育力维持调节机制研究及生殖资源库建立，并担任其中一个子课题项目组长，卵巢冷冻保存：低温生物学技术优化与生物功能维持，课题组成员有北医三院的闫丽盈博士、严杰博士，复旦大学附属妇产科医院的丁岩博士和华山医院的邵佳亮博士。闫丽盈博士现已是北医三院科研处处长。
• 现任宁夏自治区男科学会主委和宁夏精子库主任的马良宏教授，当时在华山医院读博士，完成了我申请的一项国家自然科学基金课题，精原干细胞有道分化及冷冻保存后移植研究。
• 还有我的博士生陆勇和张东亮也分别做了同种异体膀胱粘膜组织冷冻保存后用于尿道修复和细胞层片冷冻保存研究。
• 我这里还要介绍曾任国际低温学会主席的高大勇教授，他毕业于中国科学技术大学，之后在美国博士毕业，我认识他时，他已经在美国肯塔基大学做机械工程系热物理专业的教授。2004年高大勇教授北京开过一次国际低温生物学与低温医学年会。我在2003年，受邀到肯塔基大学他的实验室做了半年的器官冷冻保存与移植研究。

这里我列出了曾与我合作研究的一些单位和合作者，一并致以感谢！

PPT上用的这张海上冰川照片，一是代表冷冻，二是寓意目前人们对低温生物学的了解仍只不过是冰山一脚。

关于低温生物学与生物冷冻保存，越接触，越觉得深奥。当时在国内能找到的有关低温生物学的专业书，只有一本上海理工大学华泽钊教授编写的《低温生物学》，这本书是32开的。华泽钊教授最早在美国学习低温生物学，回国后创办了低温生物学专业。我也是从他这本书里系统学习了低温生物学基础知识。

目前，我们很多男科或生殖医学科的的医生，虽然可以用公司的试剂盒拿来再做卵细胞、精子或卵巢组织的冷冻保存，但是，我们还是要对低温生物学的理论知识有所了解。

低温生物学的定义就是研究低温对生物体产生影响及其应用的一个学科。

机体新陈代谢其实就是一种生物化学反应，它是随着温度降低而衰减的。

生物体在4°C时可以存活数小时，比如临床肾移植、肝移植、心脏移植，目前常规采用0-4°C的器官保存液。在这种保存条件下，肾脏可以保存24小时，肝脏保存12小时，心脏4-6小时。

一般来说，生物体在-40°C条件下能保存数日，-80°C条件下可保存数月，-196°C (液氮温度)下可望保存几个世纪。

根据温度条件不同，活性生物样本的保存可以分为两种：低温保存（Hypothermic preservation）和深低温冷冻保存（cryopreservation）。

• 低温保存：就是指0-4°C冰水的温度的保存。而在冷冻保存的降温和复温过程中，因为细胞内外冰晶的形成，会造成细胞的机械性损伤，另外还有冷冻保护剂的化学毒性作用。
• 深低温冷冻保存，第一步就是冷冻保护剂（CPA）的导入。冷冻保护剂分两种，一种是够进到细胞内的，称为细胞内冷冻保护剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）或甘油；细胞外冷冻保护剂多数是一些大分子的糖类，如蔗糖、蔗糖或者海藻糖。冷冻保护剂导入细胞的目的就是把细胞内的水分脱出来，通过CPA调节细胞跨膜渗透压的差别，细胞内的水分会从细胞内跨膜渗透到细胞外。

在第二步冷冻降温过程中，因细内胞水分已经减少，降温过程中细胞内冰晶的形成也会减少，从而避免机械性损伤。但是，如果细胞脱水过多，又会因为细胞膜或细胞器囊破过度皱缩，造成细胞器的损害。一般认为，从0°C到-40°C是最容易形成冰晶阶段，细胞结构损伤的风险也最高。

• 冷冻降温主要有两种方式：一种是程序化的缓慢降温，另一种是快速降温，又称为玻璃化冷冻（vitrification）。
• 玻璃化冷冻，是用一种高浓度的冷冻保护剂，比如用7.5M的DMSO。细胞内存在高浓度的冷冻保护剂，在降温过程中维持液态，不会有冰晶形成，因而减少对细胞膜及细胞器的损害破坏，但是这种玻璃状态又使得细胞结构稳定性较差。

冷冻保存的第三部是复温：

• 复温是让冷冻保存的生物样本恢复生物活性，这个过程非常复杂。
• 复温后，还要让细胞内的冷冻保护剂再出来，让细胞恢复到正常形态和含水量。过去20多年，我跟很多低温生物学家以及一些热物理学家探讨过冷冻后复温的方法及其对生物体的损伤。

低温医学和低温生物学和生殖医学的发展一直密切相关。

• 1949年英国Polge等首次报道精子冷冻成功。他们无意中把甘油添加到种牛的精子中，冷冻保存的精子复温后，精子的活性得以满意保存。
• Whittingham等在1972年首次报道小鼠受精卵低温保存成功。
• 1983年Trounson等首次报道冷冻胚胎生育成功，
• 1994年Gosden等报道卵巢组织冷冻成功，
• 2002年王翔等首次报道大鼠完整卵巢冷冻保存后移植成功。

目前冷冻胚胎移植已经在生殖医学中心常规临床操作，已经是一个非常成熟的技术。胚胎移植一般需要穿刺获取多个卵泡，这种促排卵对女性其实是一种伤害。

• Gosden教授是卵巢组织冷冻保存领域的开拓者，2020年他从英国Lee's Hospital 转到加拿大麦吉尔大学生殖医学实验室主任，他的很多学生临床开展了冷冻卵巢组织的生育力保存。
• 在2000年下半年到2001年上半年，我和Gosden教授合作，研究完整卵巢性腺器官的冷冻保存与移植研究。
• 考虑到卵巢组织薄片载荷的卵泡不多，冷冻后再移植也不能发挥卵巢内分泌功能。
• 作为一名从事器官移植的外科医生，我提出的想法是通过显微外科手术和器官动脉灌注冷冻保护剂，实现完整器官冷冻保存。我觉得自己的运气很好，蒙特利尔的冬天非常寒冷，零下二三十度，似乎预示着那里很适合做冷冻保存研究。我们的研究团队，还有美国的妇产科医生Kim Samuel教授。
• 2002年初，我们在Nature杂志首次报道了大鼠完整卵巢卵巢冷冻保存后移植成功，当时成功是因为成功获得了冷冻卵巢移植后受孕胚胎。
• 后来，我们参与乔杰教授的973课题，又有新的突破。

总体来说，低温生物学是一个交叉的学科，涉及到很多的学科，包括生殖医学、泌尿男科、器官移植，生物材料，热物理学等。

单靠医学背景是没法来完成这件事情，所以我在该领域的研究工作中，一直在跟理工科的一些教授联系和合作。

生育力保存非常受重视，而且也是临床的一个需求。

因为大剂量的化疗往往造成永久性不育，特别像血液病骨髓移植、胃癌，乳腺癌。放疗达到一定剂量的时候，也会产生永久性不育。

在生育力保护方面，我们应该做一些预防，包括：

• 我们对阴囊部位尽量避免X线照射或CT，可以选择磁共振或B超
• 特别注意隐睾的认识和尽早处理
• 包茎与阴茎癌早期诊治青少年睾丸扭转的认识和紧急处理。
• 小儿腮腺炎的积极防治
• 睾丸占位的早期诊断和鉴别诊断
• 性病与精道梗阻
• 精索静脉曲张的诊断与手术治疗
• 保留勃起神经功能的前列腺、膀胱癌、直肠癌等盆腔肿瘤手术，等等

美国临床肿瘤协会（ASCO）最先于2006年发表了关于生育力保存的基于循证医学基础的临床实践指南，2013年予以更新。

2018年发表了最新的指南:

对于有保留生育功能意愿的女性肿瘤患者，相关医疗人员应当在治疗开始前探讨保留生育功能的可行性。

• 相关医疗人员应将那些有保留生育功能意愿或有所顾虑的患者推荐给肿瘤专家及生殖专家。
• 为获得更多的选择机会，相关保留生育措施应当在治疗开始前尽早探讨。当患者在完成治疗后随访和（或）正在考虑妊娠时，相关讨论和（或）转诊或许也是必要的。讨论内容应记录在案。

当然，这里面生育力保存还有一个伦理的问题，这里面我们也要有慎重。

• 生育力保存的技术成功率有限，因此可能带来过高的期望和随后造成社会心理的伤害。
• 针对幼年期/青春期提供生育力保存，年轻患者可能并没有足够成熟的心理和能力去做决定，需要一个机构审查委员会批准来自父母的知情同意。此外，由于可能相关的妊娠禁忌证，冷冻的配子或卵巢组织有可能无法使用。
• 对于青春期的处女，经阴道的操作获取卵母细胞可能难以被父母或/和她本人接受。通过腹腔镜进行卵子的收集，具有创伤性，在没有医学缘由的情况下不予推荐。

目前针对男性生育力保存：

• 成年男性在放疗/化疗前，建议做精子保存（精子库），
• 但是对男性少儿，因为无精子产生，尚无有效方法保护生殖功能。

女性的生育力保存，这也是日益受到重视的。

放疗/化疗对卵巢功能的影响日益引起人们的重视，严重者可发生不孕、卵巢早衰及提前闭经。

选择方案：

• 卵巢功能抑制：应用GnRH-a，预防化疗药物导致的生殖毒性的作用还广受争议；
• 胚胎冻存：是一种成熟的生育力保存措施，体外受精后保存剩余胚胎；
• 卵母细胞保存：细胞体积大，水分多/冷冻损伤/成功率低（<2%）；玻璃化冷冻技术提高成功率；主要针对成人和青春期发育后女孩。2012年10月起，美国生殖医学学会不再认为这一操作为试验性。收集卵母细胞的卵巢刺激方案会增加对于雌激素敏感的乳腺癌和妇科恶性肿瘤复发（芳香化酶抑制剂补充的卵巢刺激方案）。
• 卵巢 组织冻存：无需卵巢刺激，可立即操作；无需等待性成熟，是儿童肿瘤患者可用的唯一方案。

卵巢组织冷冻后移植：是选择血供丰富的地方，如皮下或肌肉，需要血管再生，存在缺血性损伤。卵巢组织所释放的激素是完全不够的。

• 毫无疑问，完整卵巢冷冻保存可以最大限度保存卵细胞和性腺内分泌功能，但是技术难度大。
• 所以卵巢组织的冷冻保存，比较适合青春期前少女，因为不需要促排卵。

男性的生育力保存，对于成年男性是没问题。

对于儿童生育力保存，我在2003年申请到精原干细胞冷冻保存国家自然科学基金课题资助。男性少儿没有精子，但是精原干细胞是存在的。

• 精原干细胞识别、分离、冷冻保存，再自体移植。
• 睾丸组织和睾丸完整性腺器官的冷冻保存，我们也做了一些探索。

• 2014年在Nature Communication报道了日本横滨市立大学医学部小川毅彦（Takehiko Ogawa）缓慢冷冻法和玻璃化法冷冻保存新生小鼠睾丸组织。
• 解冻后，在自己研发的器官培养系统中，诱导小鼠的精子发生细胞保持分化成精子。
• 精子生成的效率与对照组无明显差别，之后他们进行了圆形精细胞注射（ROSI），圆形精细胞和精子来自超低温保存了4个月的睾丸组织，最终共发育成8个可育后代。
• 这些来自超冷组织的小鼠能够健康成长，并相互交配产生新的幼崽。

• 睾丸或卵巢组织冷冻保存后冻融培养，培养出精子或卵子发育成熟，再用于试管婴儿的辅助生育技术。
• 性腺器官冷冻保存与移植，听上去很美，性腺器官功能恢复，内分泌功能也能恢复。但是，器官结构复杂，有细胞和间质成分，并有一定的体积，冷冻和复温过程尤为复杂。

• 很幸运的是，我们首先选择了卵巢器官来做研究，因为卵巢比较软，不是一个实性器官。
• 当然，我后来也做过肾脏和心脏器官的冷冻保存，结果都不成功。肾脏冷冻保存后移植上去，血供开始还是好的，后期发现因血管内皮损伤，淤血变黑。

在蒙特利尔的卵巢冷冻保存研究历时大半年，记得每个周末我都要开车去实验，从构建移植模型到冷冻保护剂动脉灌注参数的获取，很幸运，最后获得成功。在Nature杂志发表我们的工作后，有很多记者采访。

• 很多女性对这项研究成果非常感兴趣，忙事业的女人，年轻的时候把自己的一个卵巢冷冻保存起来，在40岁的时候再移植回去，第二春就来了，这个比打羊胎素美容都好，可以保留青春。
• 甚至有些多女性还给我写信打电话，说是不是可以给她做一下，愿意做volunteer。

• 当然，这是给人了非常大的幻想，但现实并不是这样，这只是发表动物实验结果。
• 我当时觉得卵巢器官冷冻保存后移植成功了，以为其他器官也能成功，器官库的建立也为之不远。
• 后期我的确又做了很多的尝试，但是到现在为止，离成功还是很远。

2002年我回国后，拿到了很多冷冻保存方面的研究课题，2011年还负责了乔杰院长973课题的一个子课题。

我想今天听课里面有很多康中会的年轻医生，我希望如果他们有兴趣，愿意把这项研究再继续做下去的话，我非常愿意把我掌握的这些东西给大家做一些分享。

• 细胞组织器官冷冻保存原理基本上一样，但是又各有千秋。
• 冷冻保护剂配方、渗透压、PH值、灌注参数等等，都不尽相同。
• 器官冷冻保存时，冷冻保护剂灌注的浓度怎样递增？当然最好的是缓慢线性递增，最后还需要一段浓度平衡的时间。

在这项研究里，最重要是使用了两个灌注微量泵，实现了冷冻保护剂浓度线性递增，并确保了关注的流量和时间。

• 2003年，我在美国肯塔基大学和高大勇教授合作研究时，他的一个博士生物理数学功底非常好，帮我设计出了微积分方程，从原来经验性摸索，达到一个可重复的定量研究。我们用了两个微量泵，初始浓度设置为零，浓度线性递增，这个设计是非常巧妙。

• 在动态灌注过程中，DMSO浓度线性递增，前15分钟是一个缓慢的浓度导入进去，最后平衡在1.5M。线性的浓度递增，让细胞不至于突然间出现浓度的阶差，造成的细胞器的破坏，最后用五分钟时间让冷冻保护剂在器官内均衡分布。

我在高大勇教授那里得到这样一个有关冷冻保护剂浓度线性递增恒流灌注的浓度-时间-流量物理方程，我们可以通过变量的设置进行标准化定量研究。

这里列出了灌注系统的模式图和设备的实际照片。

研究冷冻降温和复温方法的改进，还要涉及组织结构，器官体积以及生物组织的热传导等问题。不同器官里面的细胞成分也不一样，还要考虑到它的组织密度，我们通过这样一个灌注系统，类似通过血液循环，将冷冻保护剂输送到器官的细胞里面。

• 在降温过程中，我们通过程序降温仪，从这个零度开始，是缓慢的下降过程，在-7°C，给予手工植冰，导致快速结冰，然后再设置为非常慢的降温方法，到-40°C。
• 接着，再以快速的每分钟10°C，降温到-80或-120°C。最后，将生物样本在液氮里面保存。

冷冻保存后的复温处理，我们采用的是快速复温方法。

将生物样本从液氮中取出后，放在室温3分钟，再放到40°C的水浴箱复温5分钟。

高大勇教授曾设想通过多模电磁场或微波进行复温。

目前的复温方法，器官外面冻融了，但是器官里面可能还是冰态。另外，在复温过程中，细胞内外还会再次出现冰晶形成，这就是器官的冷冻保存的难点和至今没有解决的问题。

高大勇教授研究的多模式微波复温的方法也不是非常满意。我尝试大鼠肾脏冷冻保存后复温，没有获得满意结果。后来，我遇到了一个我病人，他从英国留学回国，他跟我讲了“爆米花现象”，也就是在微波炉爆米花时，总会发现中间有一些米是爆不出花来的。因为微波炉里面的温度也不是均匀分布的。

啮齿类的动物，它有一个角状子宫。我们在做大鼠卵巢冷冻保存与移植的时候，也不只是卵巢，我们还取了供体与卵巢相连的子宫。

将与性腺动脉和静脉相连的一段腹主动脉和下腔静脉也完整取下来，后期与受体腹主动脉和下腔静脉做吻合，非常轻柔地把这个卵巢的动静脉完整保留。

受体两边卵巢都被切掉了，而且在一侧的子宫也切除三分之一。把供体子宫用0-8可吸收线与受体子宫吻合，相当于做了卵巢及部分子宫的带血管蒂移植手术。

开放血流后，马上血流恢复。即使冷冻保存后复温的器官组织也没有破碎。

不育大鼠模型，一种是直接切除双侧卵巢；还有一种方法是通过环磷酰化疗诱导卵巢早衰的大鼠模型，我们的团队摸索出来化疗药物剂量。

在早期的大鼠完整卵巢及部分子宫冷冻保存与移植研究实验中，十只大鼠里有四只术后恢复内分泌的功能，并且其中一只成功获得交配受孕的胚胎。

• 在国家科技部973课题资助下，我们在复旦的药学院动物实验室进行了大鼠卵巢冷冻保存与移植的深入研究，并取得新的突破。

• 接受了完整卵巢冷冻保存复温后再移植的受体大鼠，通过交配，成功受孕并分娩出了正常子代。

• 获得的子一代雌性大鼠又成功分娩了第二代。第二代中的雌性大鼠，经过交配实验，又分娩出第三代。这个实验结果非常有意义，我们发现冷冻保存的完整卵巢性腺器官，不仅完全恢复了卵巢内分泌功能，并完全恢复了生育功能。卵巢冷冻保存后移植大鼠，子一代、子二代和自三代都是健康的。
• 也就是说，我们发现卵巢冷冻保存后没有对机体产生代谢或遗传性的影响。

我们也尝试做过一些大动物，包括羊和猴子卵巢冷冻保存的研究。

• 羊卵巢冷冻保存移植以后，我们也发现卵巢内分泌功能恢复，包括阴道周期分泌物检查和血激素水平检测。
• 因为羊不好控制，在动物实验室交配实验不好操作，我们只是做了一些内分泌方面的研究和病理方面的研究，包括卵巢组织切片机卵泡方面的一些研究。12例长期存活受体中9例（75%)雌激素水平恢复正常，1个月后检查发现阴道有经期表现，2个月后病理观察发现冷冻后移植卵巢有正常卵泡生长，并发现成熟卵泡；3例雌激素水平未能检测出，解剖发现冷冻后移植卵巢萎缩纤维化。

我们也研究了卵巢组织冷冻保存技术的改良和优化，包括比较程序化缓慢冷冻和玻璃化快速冷冻。

• 通过猪和小鼠卵巢组织对比研究，我们又发现一个问题，不同实验动物的卵巢组织冷冻保存的优化方案存在动物种属特异性。比如，我们发现猪卵巢组织冷冻方案，玻璃化冷冻优于慢速冷冻；而小鼠卵巢组织，玻璃化冷冻和慢速冷冻效果没有明显差别。

我们还研究了褪黑素对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植影响。

• 首次研究发现: 褪黑素对移植卵巢组织具有促进卵泡发育成熟的作用，褪黑素对血清E2水平无明显影响，但褪黑素可影响孕激素水平。
• 褪黑素对移植至肾被膜下的卵巢组织具有促进卵泡发育成熟的作用。

• 课题组北医三院团队对人卵巢组织冷冻方法进行了比较。研究发现：慢冻组和玻冻组之间对体外培养卵泡活力无统计学差异；
• 体外培养第6和8天，玻冻组卵泡直径和存活率均低于慢冻组。
• 慢速冷冻方案冻存人卵巢组织，可以较好的保护早期卵泡，改善体外生长潜能，此方案可作为人卵巢组织冷冻保存库的方法。
• 他们还通过卵巢单细胞基因表达分析，比较了人卵巢新鲜组、慢冻组和玻冻组对卵母细胞和颗粒细胞的基因表达的影响。

• 此外，我们的研究团队研究发现，高浓度碱性成纤维生长因子（bFGF）可以显著提高移植卵巢组织内细胞和始基卵泡的增殖率，降低了凋亡率。
• 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）联合联合血管内皮生长因子（VEGF），血管内始基卵泡和次级卵泡显著高于对照组，血管密度显著高于单用bFGF和VEGF组，bFGF组和VEGF组之间血管密度无统计学差异。

我们还发现间充质干细胞（MSC）与冷冻卵巢皮质组织的共移植，可显著促进移植卵巢皮质组织新生血管形成。

• 卵巢组织移植后需要通过血管再生来提供养分，避免过多卵泡丢失。而带血管吻合的完整卵巢移植就不存在这个问题，移植后血供立即恢复。由于温度是血流灌注的一个较好指标，我们课题组采用活体红外成像技术检测移植物局部温度，从而间接反映移植物局部血流灌注情况。
• 由于多种因素，包括环境温度、湿度、小鼠的状态等均可影响移植物的温度测量。因此，我们在恒温恒湿下，采用温度差值，即移植物局部感兴趣区域的温度值与体表最高温度的差值来反映小鼠移植卵巢局部的相对温度。如图示，移植后7天开始，卵巢组织局部的血流灌注在MSC组中得到了明显的增加。
• 我们研究认为，在卵巢组织移植中，MSC可显著促进新生血管形成，提高移植物局部血流灌注，减少始基卵泡凋亡和丢失，从而一定程度提高卵巢组织冷冻移植技术在临床生育力保存中的应用前景。

我自己作为泌尿外科和男科医生，对男性生育力保存自然格外重视。我在20多年前就成功建立改良大鼠原位睾丸移植模型。

实验组大鼠（双侧睾丸切除）接受单侧睾丸移植后，雄激素水平保持正常水平，恢复生精功能，交配试验成功，交配雌鼠成功产出幼鼠。论文发表在2003年的Microsurgery杂志。

通过改进冷冻保护剂配方、灌注方法及程序降温和复温方法可以成功实现大鼠睾丸冷冻保存后移植，冷冻保存后移植睾丸可恢复正常内分泌功能，但生精功能部分受到损害。

关于精原干细胞分离识别、冷冻保存与移植研究，也是获得2005年国家自然基金的资助。协助我完成这项课题研究的马良宏博士，现在已经是中华医学会男科专委会常委、宁夏回族自治区男科学会主委和宁夏精子库主任。

• 我们将α6-Integrin可作为精原干细胞处于增殖与分化阶段的表面标志，将c-kit可作为干细胞处于分化阶段的表面标志，采用复合酶消化、差速贴壁结合非连续性Percoll密度梯度离心的方法纯化精原细胞，能获得纯度和活性较高的精原细胞，并使精原干细胞相对富集。
• 我们在上海啮齿动物实验中心，完成精原干细胞移植研究。在一个高倍显微镜下将体外冷冻保存的精原干细胞注射到白硝胺处理过不育大鼠生精小管。我们创建三切口睾丸曲细精管微注射技术,将精原干细胞准确移植入受体曲细精管内。与睾丸网或输出小管注射方法相比，效果最佳。
• 将冷冻保存的精原干细胞复温后,显微注射到经白消安处理的不育症小鼠曲细精管，可恢复其生精功能，通过体外授精技术（IVF）成功获得健康子代。

从实验结果的照片上，假孕母鼠所生的黑色和浅红色仔鼠。2008年，我们的研究结果发表在Fertililty and Sterility。

综上所述，我们的前期研究总结如下：

1. 完整卵巢冷冻保存后移植可最大限度保存女性生育力，同时可完全恢复性腺内分泌功能，特别是针对青春期前女性意义重大。
2. 睾丸精原干细胞冷冻技术成熟，重点在于精原干细胞体外诱导分化研究。
3. 卵巢/睾丸组织冷冻保存，技术难度小，易于临床转化，其安全性（遗传稳定）方面值得研究。

我们在其他低温生物学领域也做了一些探索性的研究，比如兔皮肤上皮细胞膜片组织的冻存与尿道修复。

制备的细胞膜片冻存后再移植，血管化充分，用以移植修补尿道后上皮细胞存活，尿道造影通畅。

• 我的博士生还将多层细胞膜片管制作为3D结构。细胞膜片技术（Cell Sheet Technology）的价值在于，制作细胞膜片并冷冻保存，期望在不久的将来，只需从患者身上取一小块包皮或皮肤组织，创伤极小，培养成ECS后可立即用于手术或冻存作为备份，提供自由的手术时机选择和更多的治愈机会。

上述内容，是我20多年来在低温生物学领域做的有关细胞、组织和器官冷冻保存和移植所做的一系列工作。

• 很有幸，期间我遇到一些很有名的科学家，并得到他们的大力支持和帮助，所以，才会有幸运出道即为天花板，能在《自然》Nature杂志发表第一作者文章。但是，后期遇到的天花板也是很难再突破，在这个领域仍需继续深入探索。
• 最终的突破，我还是寄托于康中会的后起之秀，当然，也是依赖低温生物学技术上的新突破。
• 从事低温生物学研究20多年来，我参加了很多相关领域的国际会议，包括国际低温生物学年会、美国生殖年会、亚太男科学年会等等。
• 在低温生物学的冷冻保存方面，我个人认为冷冻保护剂的导入和降温过程都没有问题，冷冻生物样本的复温仍是需要突破解决的关键问题。

我们最近和上海交大的一些教授共同探讨构建新型冻融体系的可行性。具体设想包括：

• 针对冻融过程多细胞内外脱水受限，局部冰晶形成对生物活性的损伤，
• 拟设计新型仿生控冰材料（重组抗冻蛋白与石墨烯纳米材料），在外加磁场复苏条件下，对生物活性的保护。
• 针对冻融损伤后重塑，拟通过复合靶向递送促进生物活性恢复，并通过基于外泌体与脂质体递送体系，复合靶向调控冻融后生物活性恢复。
• 针对冷冻保存生物样本复温方面的难题，拟应用新型仿生控冰材料，在外加磁场调控下，实现冻与融超快速热传导，在超低温条件下保护细胞及其关键细胞器功能。
• 当然，这些还是基于设想和初步设计，并没有通过科学实验验证。

我内容准备多了一点，我的汇报结束。

再次感谢李石华老师的安排和潘峰教授主持这次学术交流活动。

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《康中论坛》第43期 2024

本期论坛主持人

潘峰

本期论坛点评专家

（以姓氏笔画排序）

方丹波、李和程，柳良仁，蓝儒竹

刘晓强、王涛、王为服、武志刚

本期论坛特邀导读执笔

潘峰

本期论坛文字整理、编辑

王翔

本期视频录制及剪辑

周 梁

本期责任编辑/审校

王翔、周梁、李石华(Philip S. Li)

本期论坛策划/终审

李石华(Philip S. Li)

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