微生物药敏试验（一）：纸片扩散法

刘尧清

一、药敏试验定义解析药敏试验，即药物敏感度试验，又叫耐药试验。简单来说，药敏试验是了解某微生物（病毒、细菌等）对某些抗生素的敏感程度或耐受程度。这里的“药物”，一般指抗生素类药物。这里的“敏感度”，包括“敏感”、“中介”和“耐药”。

二、药敏试验目的

为了了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素类药物而进行的微生物学试验。1.指导治疗

为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往需要进行药敏试验。这对于避免药物滥用、降低治疗成本、缩短治疗周期都非常重要。

2.耐药监测

抗菌药物的广泛应用所产生的耐药菌株也随之增加，通过耐药监测，可以及时发现并应对耐药性问题，这对于维护公共卫生安全、控制疾病的传播具有重要意义。

3.新药验证通过与现有药物的对比试验，可以评估新药对病原体的抑制或杀灭能力，为新药的临床应用提供依据，也是验证新药疗效和安全性的重要手段之一。

三、药敏试验方法-纸片扩散法

纸片扩散法，又名Kirbv-Bauer法，简称K-B法。1.基本原理将浸有抗菌药的纸片贴在涂有致病菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断地由纸片中心向四周扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈直径的大小反映待测菌对抗菌药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。

2.试验方法

(1)样本收集

样本收集过程中，要注意避免交叉污染，注意个人防护。

(2)菌种分离

取待测样品，采用划线法或涂布分离菌种。

(3)药敏试验

①挑取培养好的纯培养物，用无菌生理盐水或MH 肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同，在15min内接种完，制备成0.5麦氏浓度的菌悬液。

0.5麦氏浓度相当于1.5×10^8cfu/mL菌悬液。

②用无菌棉拭子蘸取上述菌悬液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个MH固体平板表面，再重复2次，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭子涂布平板四周边缘。

③涂布菌液的平板于室温中干燥3-5min ，让平板充分吸收菌液。

④用无菌镊子夹取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。纸片位置固定不能再次移动。每张纸片的间距不小于 24 mm，纸片的中心距平板的边缘不小于 15 mm，90mm直径的平板宜贴6张

“敏感”是指用某种药物的常规剂量时，治疗该种细菌引起的感染有效，即使用该药常规剂量时达到的平均血药浓度达到 MIC的5倍或以上。“中介”是指当细菌引起的感染仅在应用高剂量抗菌药时有效，或者细菌处于体内抗菌药浓缩的部位或体液（如尿、胆汁、肠腔等）中时才被抑制，中介时达到的平均血浓度一般相当于或略高于对细菌的MIC。对于毒性较小的药物，适当加大剂量仍可望获得临床疗效。“耐药”是指药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液内可能达到的浓度时，或细菌能产生灭活抗菌药的酶或其他耐药机制，则不论其 MIC值大小如何，仍应判定该菌为耐药。例如产青霉素酶的金黄色葡萄球菌即应认为该菌对青霉素耐药。

四、纸片扩散法在普通微生物实验室中应用实例

1.菌种

大肠杆菌斜面菌种，金黄色葡萄球菌斜面菌种。2.培养基和试剂MH培养基，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌液

3.菌液制备

采用划线法将大肠杆菌菌种接种于营养琼脂平板，35℃培养16-18小时，然后挑取单菌落，重悬于3mL无菌生理盐水中，混匀后与标准菌液比浊管比浊。调整浊度与比浊管（ 0.5麦氏单位）相同。

4.倒平板

将MH琼脂培养基溶化后倒平板，注意平皿中培养基厚度均匀，倒3套平板。

90mm×15mm，平板厚度均匀，约4mm厚，大约1/3高度。

5.涂平板

用无菌棉棒蘸取菌液（金黄色葡萄球菌）。将多余菌液在液面上方管壁内轻轻旋转挤出，涂布在MH琼脂平板整个平面三次，每次旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀，平板加盖室温干燥5min。

6.标记

将上述平皿底用记号笔分成若干等分，分别标明一种药敏片的名称。纸片序号对应的药品：①氨苄青霉素；②链霉素；③氯霉素；④庆大霉素；⑤万古霉素；⑥卡那霉素。

7.贴滤纸片用无菌镊子取无菌滤纸片（青霉素，链霉素，等）分别贴在平板上相应位置，在平板中央贴上仅有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。轻压纸片使之紧贴琼脂表面(不要在培养基表面拖动滤纸片)。

8.培养观察将上述平板倒置于37℃恒温培养箱中培养，观察并记录抑菌圈大小。18-24小时后测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。

五、注意事项

1.没有特别说明，培养基为M-H培养基，4mm厚。

原因：产品批间敏感试验重复性好；磺胺、甲氧苄嘧啶、四环素的抑制物含量低；绝大多数致病菌生长好；有关敏感试验的数据是由此培养基得出的。M-H培养基的成分较为疏松，利于抗生素的扩散，使其可以显现明显的生长抑制带。

2.MH培养基和营养琼脂培养基的区别

MH(Mueller-Hinton)培养基指的是水解酪蛋白培养基，它是NCCLS美国国家临床实验室标准委员会采用的需氧菌及兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2-7.4。

MH的成分包括酸水解酪蛋白、牛肉浸出粉和可溶性淀粉，这些成分按一定比例混合制成，其中，酸水解酪蛋白和牛肉浸出粉提供氮源、维生素和氨基酸；可溶性淀粉具有强吸附力，可以吸收有毒的代谢产物。

3.纸片直径为6.35mm，吸水性为自身的2.5-3倍，于-14℃保存。

纸片可以直接购买药敏纸片，如果没有，在普通实验室做K-B试验也可以用滤纸代替，注意灭菌。

4.菌液浓度为0.5麦氏单位，相当于1.5×108cfu/mL。

原因：待测菌液的浓度接种量应该达到麦氏比浊的标准，菌液的浓度可使抑菌环缩小。抑菌圈的大小可反应测试菌对测定药物的敏感性，并对该药物对测试菌的最低抑菌浓度呈负相关关系。5.药敏试验一定做质控。

每次药敏试验必须用ATCC25922大肠杆菌做质控。只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。ATCC25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告在附表中。

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