1．问题背景<br>我国药典微生物检查法之“1101 无菌检查法”和“1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”均要求在培养基适用性检查和方法适用性检查通过的基础上，在每批供试品测试时仍需进行阳性菌对照试验。而国外主要药典的微生物检查中都没有要求在供试品测试时进行阳性对照试验。那么，从科学的角度看，我国药品微生物检查是否需要继续在供试品检查时进行阳性对照实验呢？药典将来的修订，尤其是中国药典与ICH Q4B的对接，是否可以允许在供试品检测时不进行阳性对照实验呢？本文将从科学和风险的角度对该问题进行分析阐述。<br> 2. 微生物检查时阳性对照试验的作用和意义<br>欲回答以上的问题，首先须澄清微生物阳性对照试验在微生物检验中的作用。在供试品微生物测试时进行阳性菌对照试验的唯一目的和作用是确证（verify）目标微生物（潜在的微生物污染或控制菌）在所使用的培养基的正常培养条件下会正常生长，从而使得供试品所污染的微生物在所使用培养基的正常培养条件下不生长而出现的假阴性结果得以显露。通俗地说：如果一个微生物测试中的阳性对照菌没长，说明该试验一定有问题；其测试结果，尤其是阴性结果，是不可靠的。需要注意的是：阳性对照菌生长了，可以增加测试者对试验的信心，但并不说明实验就一定没有问题，这是由微生物特点及实验方法的复杂性决定的。所以，只有在阳性对照试验不长的情况下，阳性对照试验才会真正发挥其作用，即显露实验可能存在问题。特别值得指出的是：只有阳性对照菌不生长时，阳性对照试验才能“显示”实验有问题；它本身不可能避免实验的问题或失误，更不可能避免假阴性。<br> 3. 供试品检测时不进行阳性菌对照实验的风险<br>既然供试品检测时进行阳性菌对照实验的作用是确证目标微生物在所使用的培养基的正常培养条件下会正常生长，那么在供试品检测时不进行阳性菌对照实验是不是也可以证明或有信心相信目标微生物在所使用的培养基的正常培养条件下也会正常生长呢？答案是肯定的。 <br>这是因为药典微生物检查所使用的培养基和所采用的检测方法须经过培养基适用性和方法适用性试验。其目的是为了确认目标微生物在既定实验方法、培养基和培养条件下能够正常生长。微生物科学原理决定了只要目标微生物在该实验方法、培养基和培养条件组合下的生长经过确认，在后续的供试品检查中结果就会重复，即不会出现一批试验生长，而另一批又不生长的情况。当然，这个结论的前提是实验方法、培养基和培养条件的组合要保持一致。任一条件因素之改变或不一致就有可能导致上述结论之偏离。 下面分别阐述这三个因素：培养基、培养条件和实验方法。 <br>一是培养基。它有三个方面：批次内的均一性、批次间的一致性和效期稳定性。这三个方面都要回答同一个问题：是不是通过了“方法适用性试验”的培养基会在不同的使用时间会产生不同的结果，即有时候生长，有时候又不生长？这种风险的发生可能性极其微小，这是因为：首先，每一批的培养基都会经过批放行，而批放行的依据之一就是目标微生物的促生长（grow promotion）试验。通过促生长试验的培养基批次才可以被放行使用。该试验可以消除批次间的差异顾虑。其次，同一批培养基是均质的（依据批次定义），该批次的培养基（盘或管）在进行同样方法的检测时都会产生同样的结果，即目标微生物会生长。不应该出现某些盘子生长，另一些又不生长的情况。最后，同一种培养基的有效期（使用期限）也是经过验证的，在效期内的培养基不会因为时间因素而产生不同的结果。不会出现这次试验生长，下次实验又不生长的情况。当然，以上这两个结论是基于培养基之储存是符合要求的（见下文陈述）。<br>二是培养条件。众所周知，如果培养条件不合适，即便培养基正确，目标微生物可能也不会正常生长或生长不好。培养条件是由微生物培养箱提供的。目前国内的微生物培养箱的硬件都是经过确认的，其设计也都是控制探头和显示探头分开的，并且设有报警功能。试想一下：什么样的培养条件才会导致目标微生物不正常生长？唯一的情况是培养箱控制探头失灵，不加热升温或过度加热，而且显示探头也同时失灵，没有报警，并且这期间没有分析员观测到培养箱的异常。这种情况的发现可能性几乎为零。况且，即便是培养箱在室温下（没有加热），许多微生物还是会生长的。<br>三是无菌检查的实验方法。这包括由实验员完成的所有操作，即根据检查目的和目标微生物选择或配制正确的培养基，制备正确的稀释液、供试品菌液、阳性对照菌液和阴性对照，按正确比例稀释，按正确接种浓度/量接种，选择正确的培养箱和正确培养参数等等。 这也往往是许多专家对国内目前GMP水平信心不足，忧心忡忡的地方。 那么实验员的操作失误会对实验结果产生怎样的后果呢？阳性对照试验又能否弥补实验员操作之失误呢？这需要从以下几个方面探讨。<br>首先，经验表明微生物检查操作失误（实验员培训不到位，GMP保证水平不高等等）往往会导致微生物污染，出现假阳性结果。而假阳性结果不应该存在对患者的风险。<br>另外，理论上实验员的微生物实验操作失误一般情况下不会造成“去”微生物污染，也就是使得供试品中所污染的微生物在实验中不生长，从而出现假阴性结果。即便假设这种情况会发生，那关键问题是：在供试品测试时进行阳性对照试验是不是就可以防止出现假阴性实验结果？要回答这个问题，我们需要进一步探讨实验员的操作失误可能会导致供试品假阴性的情况：<br>1. 使用了错误的培养基，而且该培养基会抑制供试品中污染微生物的生长。这已经是小概率事件了。况且如果用错了培养基，阳性对照不一定总是能够显示出该错误，因为该错误的培养基不一定也抑制阳性菌的生长。如果阳性对照试验正常，就不能彰显用错了培养基错误。<br>2. 供试品试验操作中引入了消毒剂、抑菌剂或抗生素等等。抑菌剂和抗生素在微生物实验室不是常规使用试剂，不会轻易被误用。唯有消毒剂的误用性较大，但存放消毒剂的容器与实验试剂用容器差别极大，通常不应该会被误加到试剂中。最可能发生的情况是消毒剂被误喷洒到培养基上。即便有消毒剂被误喷洒到供试品的培养基的情况发生，那需要足够多的量才能完全消杀供试品中的污染微生物，而且消毒剂又没被喷到阳性对照的培养基上，阳性对照会生长，只有这种情况，假阴性结果才可能不被发现。只有当消毒剂、抑菌剂或抗生素被误用到阳性对照试验的培养基上时，阳性对照试验才会发挥其作用（彰显实验员的实验错误）。因此，阳性对照试验的价值对于误用了消毒剂（包括抑菌剂或抗生素）意义也不大。<br>3. 供试品稀释比例过高或接种量过低。如果供试品被过度稀释或接种量太低，可能会掩盖污染微生物的生长。但是，由于阳性对照的菌液不采用同样的稀释和制备方法，因此，阳性对照不会被过度稀释或过低接种，即会正常生长。如此，假阴性的结果并不会被彰显。因此，阳性对照试验的价值对于错误的稀释比例和接种意义也不大。<br>4. 供试品的抑菌效应没有被正确去除。这种情况阳性对照依旧正常生长，供试品的污染微生物没有被检出也不会被发现。因此，阳性对照试验对于供试品的抑菌效应没有被完全去除的情况没有意义。注：在供试品测试时，阳性对照试验菌液不会被参入供试品的制备液。<br>以上4点分析表明，在供试品检测时进行阳性菌对照试验对彰显由实验员操作失误而导致的假阴性意义不明显。<br>综合以上对培养基、培养条件和实验操作的分析，在供试品微生物检测时进行阳性菌对照试验并不能总是彰显微生物测试的假阴性结果。<br> 那么，如果在供试品检测时不进行阳性对照实验，还会有哪些情况会导致假阴性结果的风险？<br> 药企没有对每批所使用的培养基都进行“促生长”试验或方法适用性实验。显然如果一批培养基没有被证明其能够促微生物生长，其阴性测试结果并不可靠。但是，这种情况属于合规问题，而非技术范畴的问题。在目前的监管形式下，应该极少有发生。 当然，如果企业没有在培养基放行之前进行促生长试验，建议对培养基批放行增加此项检查。<br> 培养基的存储时间和条件可能会影响培养基的质量，从而导致培养基在保存一定的时间后，如失水，影响微生物的生长。这可能是需要在每一批供试品测试时均进行阳性菌对照的现实理由。但是，公司的GMP和质量管理体系应该确保培养基的存储条件，监管机构的GMP检查也应加强复核药企对培养基的制备、接收、放行、储存的执行情况。<br>另外，阳性对照试验在无菌产品的微生物检查和非无菌产品的微生物限量检查包括控制菌的检查中的作用不完全一样。非无菌产品的微生物限量检查包括控制菌的检查中的阳性对照试验结果可能会被用于供试品生长菌落的形态对比和帮助结果判断。这种对比和判断可以通过图片等方式代替，也可以通过实验室微生物专家复核确定，最终还是要以微生物鉴定的结果作为判断依据。当然，如果企业没有对供试品控制菌阳性的微生物进行鉴定，这是不符合药典要求的。<br> 4. 结论<br>综上所述，阳性对照试验对彰显由实验员失误可能导致的假阴性意义不大。 加之，自2010版中国GMP实施以来，国内制药企业的GMP水平大幅提升，尤其是GMP监管水平的提高，使企业完全有能力确保培养基的采购/制作、接收、放行、存储、使用之规范性，这包括对每批培养基进行促生长试验和检验方法的“适用性试验”，提供可靠的培养基存储条件和可靠的微生物培养设备以及经培训的微生物检测人员。即便是个别药企的GMP管理水平有限，测试人员素质一般，在供试品检测时由于人为错误导致目标（污染）微生物在所使用的培养基上不生长的可能性极其微小。而且供试品测试中的阳性对照试验并不总是彰显实验员的操作失误。相反，不规范的无菌操作往往会污染供试品，导致假阳性的微生物检测结果。但是这并不会给患者带来风险。<br>因此，在微生物检测时，对每批供试品的检测都必须进行阳性菌对照实验的要求已经不再能为药品的微生物控制或无菌保证增加价值。监管机构应该可以允许企业基于产品特性、工艺和微生物控制的风险决定是否进行供试品测试的阳性对照试验。<br> 作者注: 本文所陈述之观点争议颇大，文中观点纯属个人己见，且不代表任何公司、组织和机构。欢迎留言探讨不同的观点。