一例血培养少见菌的诊断经验分享

✨董董☂__ღ

7月29号，厌氧瓶在36.6h后报阳。

抽取瓶中培养物涂片革兰染色, 镜下见革兰阴性长杆菌。

厌氧瓶，革兰染色X1000倍

　　在咨询带教老师后认为是芽孢杆菌。芽孢杆菌？革兰阳性杆菌（有时候染色不定可染成阴性）不太确定，先不报危急值，第二天观察平板生长情况再定。

那么，问题来了，芽孢杆菌的话不需要报危急值？血培养阳性的哪些是病原菌呢？【8】持怀疑态度的我，决定还是让陈老师鉴定一下。

陈老师在纵览全片从形态的大小、染色性状、厌氧瓶分离等情况，疑似纤毛菌。~什么是纤毛菌？【1】纤毛菌血液中很少见，感染的来源在哪？其适应症在哪里？要查查原发病灶。同时讲解了纤毛菌在人体的栖息部位（口腔和生殖道），应从分离菌的栖息部位；以及栖息部位有无相关感染症状进行排查。在一系列设想后，与临床沟通才能得证实。联系主管大夫后，得知该患者有牙龈炎和扁桃体炎且无口腔介入性操作，是一名免疫力减退的白细胞增多症病人。放下电话陈老师说：”那没错了，应该是口腔纤毛菌。”虽然纤毛菌是正常菌群但是在免疫功能低下可能是纤毛菌感染的高危因素。

　　按照血培养报阳程序进行危急值初报告，同时接种5%羊血平板、巧克力平板、厌氧平皿，加做耐氧实验。【3】

　　72h血平皿未见明显菌落生长，厌氧板可见明显菌落生长。耐氧实验阴性。按正规流程向临床报告危急值，为厌氧菌。

血平皿，72h

厌氧平皿，72h

菌落特征：直径约2mm，光滑，不透明，圆形，干燥，菌落边缘不整齐，菌落成灰褐色。

生化反应，氧化酶（—）、触酶（—）

　　厌氧菌只是初步结果，是哪种厌氧菌呢？如何鉴定？实验室没有ANC卡怎么办？【5】还好有质谱，质谱报告结果，口腔纤毛菌，与陈老师通过形态和临床表现得出的结论一致。

M47关于血培养危急值的报告中指出，要在60分钟内报告危急值。厌氧菌传代培养培养要48小时才能打开气袋看菌落生长情况，这符合工作流程，但又不符合指南的要求。第二天从厌氧袋外观察到菌落生长，此时报告也超出了危急值规定的报告时间。

　　从涂片染色到怀疑纤毛菌到与临床沟通，进一步怀疑口腔纤毛菌，不到半小时，检验时长是其他方法达不到的。由形态学来完成血培养危急值的初级报告，对临床提早正确的干预治疗有着无可替代的重要意义。

　　陈老师凭借多年的专业积累，从涂片染色到怀疑纤毛菌，再到得知患者情况后进一步怀疑口腔纤毛菌，不到半小时，检验时长是其他方法达不到的。由形态学来完成血培养危急值的初级报告，对临床提早正确的干预治疗有着无可替代的重要意义，当然这就要求阅片人员具备丰富的专业知识和经验技能。【9】

通过这个病例可以看到，厌氧菌检验的必要。形态鉴定无疑是其最快速和有价值的方法。【4】

番外篇

　　8月3日此名患者第二次送检的4瓶血培养中，两瓶需氧瓶报阳。不是厌氧菌么？厌氧菌在需氧瓶里长吗？难道这次又长了新的菌？还是假阳性呢？处于迷惑的我又找来了陈老师。陈老师说：“先不急，先看看曲线。”

观察两报阳需氧瓶曲线，较平缓上升，无明显的上升坡度，怀疑假阳性。

假阳性

假阳性

在观察培养瓶底部颜色：

右边是阴性瓶，左边是2个阳性瓶，瓶底符合阳性瓶特征，无法判定真假阳性

在进行涂片形态观察：

酒精热固定，红细胞完整，背景清晰。火焰固定，红细胞破碎，背景一片红。【2】

瑞氏染色✖1000倍

视野下，有核细胞很多，怀疑是细胞代谢造成的假阳性。

涂片未见细菌，假阳性证实。

查询其他检验项目，2瓶需氧瓶送检当天，血常规示：白细胞异常增高，如下图：

假阳性需氧瓶涂片未见细菌，假阳性证实。

8月4日平板未见菌落生长，8月5日平板仍未见菌落生长，再次确认假阳性。

结论：这是一例由于白细胞异常增高，细胞代谢增高引起的假阳性，也是血培养假阳性的常见原因。同时，也可以看到涂片对于检验的整个过程都是非常必要的。

与阳性厌氧瓶图片染色对比：

厌氧瓶、阳性、瑞氏染色X1000倍

厌氧瓶、阳性、瑞氏染色X1000倍

⭐️由于实验室条件未能对此菌进行药敏实验。

我们来整体回顾一下此病例：

1.患者由于发热入院，伴乏力，咽痛，牙痛、肛周肿痛、盗汗、干咳，活动后气短等症症状。

2.入院实验室检：WBC：169.25×10^9/L、Hb：91g/L、PLT：85×10^9/L、EN9.6%、LY1.8%、MO68.6%、MCV94.3fL。补体、免疫球蛋白检查正常。大便常规正常肝肾功能基本正常。骨髓涂片检查确诊为急性淋巴细胞白血病。住院期间给与免疫抑制性治疗、于发热当天起给予氨曲南、炎琥宁、维生素C、抗感染治疗。症状无明显改善，体温无降低。

3.治 疗2ｄ后患者热峰升至38℃，热型不规则，疗效不佳，考虑到患者化疗伴高热，改用美平、万古霉素。

4.疗 程 第3d，血培养结果提示,为厌氧菌，将美平加量静点抗感染。患者发烧现象无缓解，体温高达39.6℃。牙齿持续肿痛。停用美平，万古霉素给予泰能，斯沃、伏立康唑、头孢哌酮舒巴坦。6d后体温恢复正常，症状逐渐消失。【6】【7】

总结与改进

1.什么是纤毛菌？

纤毛菌属( Leptotrichia)隶属于细菌域，梭杆菌门(Fusobacteria)，梭杆菌纲(Fusobacteria)，梭杆菌目(Fusobacteriales)，梭杆菌科(Fusobacteriaceae)。目前属内有7个种，包括口腔纤毛菌(L .buccalis)、古德费洛纤毛菌(L. goodfellowi)、霍夫斯德纤毛菌(L.hofstadi)、香港纤毛菌(L.hongkongensis)、沙阿纤毛菌(L.shahi) 、特雷维桑纤毛菌(L. trevisani)和韦德纤毛菌(L.wadei)等。羊水纤毛菌( Leptotrichia amnioni) 没有被认可，目前称为羊水斯尼斯菌。

纤毛菌属DNA G+C含量为25~29.7mol%,代表菌种为口腔纤毛菌。

纤毛菌（Leptotrichia）属于人类正常菌群，常寄居于人类口腔及女性生殖道，为条件致病菌，可造成免疫力正常或低下患者牙周炎、牙龈炎、菌血症、败血症、阴道炎甚至流产。

⭐️ 形态与染色

纤毛菌属细菌为革兰阴性长杆菌，口腔纤毛菌，霍夫斯徳纤毛菌，沙阿纤毛菌和特徳维桑纤毛菌，新鲜培养物常染色为革兰阳性，菌体大小0.5-3.0×0.5-1.5m，菌体直或弯，一端或两端尖或圆形，常成对，独立细丝或链状排列，菌体内有革兰阳性不均匀颗粒。不形成分枝或棒状，无鞭毛，无动力，无芽孢。

纤毛菌显微镜下形态

⭐️培养特性

本属细菌在初代培养时需厌氧环境，次代培养即可在微需氧环境中，如烛缸内或其他含CO2的环境中生长。最适生长温度为35 ~ 37°C,大部分菌种在25°C或42°C不生长(除外口腔纤毛菌),培养基的最适pH为7.0~7.4。营养要求较高，在含胰酶蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、半胱氨酸和动物血清(血浆)的培养基上生长良好。在含5%人血哥伦比亚或脑心浸出物琼脂平板上37°C厌氧孵育2~6天，形成直径0.5~3 mm、光滑、不透明、凸起似人脑回盘旋状菌落，菌落边缘不整齐，郁-溶血或不溶血，常有丝状突起或形成不规则球状小体，菌落可呈灰褐色。

厌氧培养，5D

⭐️生化反应

纤毛菌属氧化酶阴性，触酶阳性(口腔纤毛菌阴性)。口腔纤毛菌发酵葡萄糖、蔗糖，大部分菌株能发酵乳糖、纤维二糖、水杨苷和海藻糖等产酸不产气，不发酵阿拉伯糖和木糖，水解七叶苷，不产生吲哚，不还原硝酸盐，不液化明胶，在20%胆汁中可以生长。

纤毛菌属内菌种主要生化特性

摘自—《临床微生物学检验图谱》

2.为什么革兰染色要固定？

固定的目的有三点：

(1)杀死微生物，固定其细胞结构。改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色

（2）让菌膜贴附在玻片表面，在后期染色和冲洗的时候不易被冲掉。

（3）使染色的微生物形态固定，甚至使微生物失活。如果不进行固定再做一些需要加热的芽孢染色时冲洗后就都没有了。另外有些组织抹片脂肪含量较高不适合使用火焰固定，可以选择甲醇固定。

3.什么是耐氧实验？

当厌氧培养平皿上的厌氧菌与兼性厌氧菌混合生长时，为了确定是否为厌氧菌，一定要做耐氧实验，耐氧实验挑选同一个菌落同时接种厌氧血平皿和普通血平皿，分别做厌氧培养和需氧培养，若厌氧培养有细菌生长，对应需氧培养不生长，则为厌氧菌。有些微需氧菌在5%-10%CO2培养中生长好，而在需氧、厌氧培养生长不好的细菌，应置5%-10%CO2培养（厌氧球菌、纳使放线菌、蛛网丙酸杆菌等）

4.开展厌氧菌的重要性？

据文献报道，在菌血症中有10%可检出厌氧菌，牙周炎及牙跟管炎厌氧菌感染率高达96.67%～100%，肺部厌氧菌感染率高达41.1%～84.2%，厌氧菌和需氧菌混合型感染率高达82.23%。由此可见，厌氧菌培养非常重要，尤其是在有复杂的基础疾病，而菌血症原发部位又未知的情况下。从进行了腹部或妇科手术、腹腔脓肿、污染的伤口、压疮、骨髓炎、扩散性口咽疾病的患者采集血液应当检查厌氧菌。

5.基层实验室在没有配备ANC鉴定卡和质谱的情况下，应该如何鉴定厌氧菌呢？

由于基层实验室配备的条件的差异，在没有质谱和鉴定卡的情况下该如何进行对厌氧均的鉴定？即便不能鉴定到种，但是通过形态学的鉴定也可鉴定到属。

临床医生一般希望通过初步细菌检验报告尽证实有无厌氧菌感染，而不是某一种菌。因此，检验科应加强厌氧菌的分离，再根据条件建立简易鉴定流程或复杂流程; 以涂片方式报告，如革兰阳性球菌、厌氧杆菌、革兰阴性厌氧球菌、厌氧杆菌。可以快速提供病原菌，从而优化抗生素的使用。所以说毋庸置疑，涂片染色是最快速的检测方法。

上所述，基层医院鉴定厌氧菌可以从以下几个方面入手：

1.熟练的革兰染色读片技术可大大提高鉴定准确率。

2.观察菌落形态

3.耐氧试验

4.生化反应

5.有条件的医院可以用ANC鉴定卡和质谱鉴定到种。

附赠：厌氧菌检验流程

6.抗厌氧菌的治疗有哪些？

目前美国临床和实验室标准化协会的抗微生物药物敏 感性试验判断标准中没有纤毛菌药敏数据，据有关文献显示，纤毛菌对第三代和第四代头孢菌素及碳青霉烯类抗生素较为敏感，对 大 环 内 脂 类、喹 诺 酮类及氨基糖苷类抗菌药物敏感性较差。临床也可推荐阿莫 西林等青霉素类抗生素治疗，疗效不满意者可更换头孢菌素 类或碳青霉烯类。纤毛 菌 感 染，临 床 预 后 较 好。

下表总结了目前临床使用的抗大多数革兰阴性厌氧菌药物的活性。

-摘自《临床微生物学手册》

摘自《厌氧菌感染的临床处置误区与抗厌氧菌药物的合理使用》

7.为什么血液病人在报告厌氧菌后未抗厌氧菌药物？

从上一个问题我们可以看出，硝基咪唑类对大多数厌氧菌具有杀菌作用，能够覆盖大多数厌氧球菌，类杆菌，梭杆菌。例如，甲硝唑，然而，对与血液病人来说，服用此类药物会有骨髓抑制作用。

8.血培养阳性的哪些是病原菌呢？

在某些情况下，通常与血培养污染相关的微生物（如芽孢杆菌属、棒状杆菌属、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、气球菌属、微球菌属）也能够引起系统的血源性感染。在许多情况下，一种潜在的污染菌，可从单独一套血培养的一瓶或两瓶中发现，如果没有第二次血培养的结果进行比较，确定一种可疑菌的意义几乎是不可能的。因此，对于一株从单独一套血培养（一瓶或两瓶）中发现的低毒力菌株，我们对其评价只能限于一定的程度，即从医学重要的微生物中排除。在同一病人的血培养中多次发现同一细菌，在保证细菌鉴定的前提下，以初始分离株的药敏试验为准。——摘自《M47》

9.形态学对于检验结果的重要性？

《临床微生物学手册》中提到，革兰染色仍然是最简单、最快捷而且最有可能获得有价值信息的检验项目，所有厌氧菌培养标本都应该进行。理论和实践证明，形态学对早鉴定以及整个检验过程都有着不可比拟的重要意义。

M47中指出血培养阳性应三级报告：初步报告涂片结果，二级报告初步药敏结果，三级报告最终药敏结果。涂片看形态决定了初级报告，初级报告的准确，最先给临床提供用药依据。同时可以作为整个检验过程的质控。所以，形态学对于血培养是至关重要的。

以后的工作中需要改进的方面：

1.认真学习各种厌氧菌的形态，镜下形态能够最快速的为临床提供最有价值的信息。

2.学习借助厌氧菌的菌落特征，耐氧试验，选择性培养基，溶血性，色素产生，芽孢形成，细菌生长特性，生化试验等来鉴定到属或种。

3.厂家是否可以协调调度区域间ANC卡的使用，避免不必要的浪费。

4.质谱是新一代快速鉴定的手段，随着临床病情的需求增加，越来越多的医院可能都会逐渐开展此项检测。

文章最后：小编极力推荐陈老师的《临床微生物学检验图谱（电子图书）》，便携、方便、快捷，随时查阅，对于日常基层工作者有很大的帮助！

图文编辑：董家丽 张洁

指导老师：陈东科

冰心常说：“成功的花，人们只惊羡她现时的明艳！然而当初她的芽儿，浸透了奋斗的泪泉，洒遍了牺牲的血雨。”

陈老师30年来积累的涂片库，入库的已有3万多张，工作量超乎长人，这需要多大的耐心和毅力，一点一滴积累而来。

陈东科，男，1961年出生，副主任检验师。就职于北京医院检验科微生物实验室，从事临床微生物学检验工作近三十年，在感染性疾病病原学诊断、病原菌的分离与鉴定、病原微生物形态学、病原菌耐药监测、菌种保存、抗生素药效学研究方面有深入研究。发表论文70余篇，主编专著3部《实用临床微生物学检验与图谱》、《临床微生物学检验图谱（电子图书）》及《实用临床微生物学检验与图谱》（第2版），副主编专著3部，参编专著10部。主持科研课题4项，直接参与课题工作26项。参加国家八五攻关课题《肺心病绿脓假单胞菌感染的发病机理与防治》的研究工作，获北京市科学技术叁等奖1项。获局级新技术奖及成果奖27项。获国家实用新型发明专利2项。受聘为《国家食品药品监督管理局医疗器械技术审评中心》审评专家、《国家创新医疗医疗器械特别审批申请审查专家组》专家、《国家食品药品监督管理总局医疗器械技术器审中心（CMDE）医疗器械技术审评专家咨询委员会》委员、北京大学图书馆《中文核心期刊要目总览》审评专家、《中国医师协会检验医学分会》第三届委员会委员、《中国医师协会检验医学分会老年病检验医学专家委员会》委员、《中国医师协会检验分会微生物质量控制专家委员会》委员、《中华医院感染学杂志》第四届编辑委员会编委、《中国热带医学》杂志第三届编委会委员、《中国抗生素杂志》第十届编辑委员会委员、《临床检验杂志》第六届编辑委员会委员、《临床检验杂志（电子版）》形态学检验专家委员会委员编委、《器械装备协会检验专委会网站学术论坛》编委、《中国医学装备协会临床检验装备技术专业委员会网站学术论坛学术交流栏目》编委小组成员、万方医学网《临床诊疗知识库》感染科疾病专家委员会专家委员、《梅里埃抗感染与实验诊断杂志》编委、《生物梅里埃大学》客座教授，兼任《中华医学杂志》、《中华检验医学杂志》、《中华流行病学杂志》、《临床检验杂志》、《中国抗生素杂志》、《中国热带医学杂志》、《中华老年骨科与康复电子杂志》、《中国计划生育学杂志》审稿专家。被国家卫生计生委合理用药专家委员会聘为《卫生部全国基层医疗机构微生物检测培训项目》（“萌芽”计划）实践培训指导老师及《全国细菌耐药监测网》培训专家。曾今在《微生物之家论坛》（www.clsi.com.cn）里担任多个版块的版主工作